选择性必修3 生物技术与工程（专项训练）-2027届高考生物模块精炼与题型分类突破（河南专用）

"**基本信息** \n聚焦生物技术工程三大模块，以河南模考题为载体，构建\"原理-技术-应用\"三维训练体系，强化科学思维与探究实践能力。 \n**专项设计** \n|模块|题量/典例|题型特征|知识逻辑| \n|----|-----------|----------|----------| \n|发酵工程|15题（濮阳二模/郑州二测）|以微生物培养、发酵条件控制为核心，结合传统发酵食品案例|从菌种筛选（稀释涂布平板法）到发酵过程优化（溶氧/pH调控），体现工程学原理的应用| \n|细胞工程|15题（洛阳检测/九师预测）|聚焦细胞融合、单克隆抗体制备、胚胎工程，突出实验操作细节|遵循\"细胞全能性-培养技术-临床应用\"逻辑链，衔接植物组织培养与动物细胞工程| \n|基因工程|24题（新乡三模/开封二模）|涵盖PCR扩增、载体构建、基因编辑等，大题突出实验设计与结果分析|以\"工具酶-目的基因获取-表达载体构建-检测鉴定\"为主线，整合蛋白质工程与基因治疗应用|"

2027届高考高三复习模考题专项训练-河南版-选择性必修三 第一章：发酵工程 1．（濮阳二模）Ca2+是细胞生命活动的关键离子，在动植物生理及生物技术中参与多种过程。下列叙述错误的是（　　） A．可用高Ca2+-高pH融合法促进植物原生质体融合，进而获得杂交细胞 B．PCR实验中，Ca2+可激活耐高温的DNA聚合酶，保障DNA扩增的高效进行 C．哺乳动物血液中Ca2+浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐等症状 D．用Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【答案】B 【知识点】兴奋在神经元之间的传递、PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、植物体细胞杂交技术 【详解】A、植物原生质体融合的化学诱导方法包含高Ca2+-高pH融合法、PEG融合法等，可促进原生质体融合进而获得杂交细胞，A正确； B、PCR实验中，是Mg2+作为辅因子激活耐高温的DNA聚合酶，保障扩增高效进行，B错误； C、哺乳动物血液中Ca2+可调节神经肌肉兴奋性，浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐症状，C正确； D、基因工程操作中，用Ca2+处理大肠杆菌可使其处于感受态，能够更容易吸收周围环境中的DNA分子，D正确。 2．（濮阳二模）科研人员从健康水稻根际土壤中，筛选能抑制稻瘟病菌生长的芽孢杆菌，流程如下图。为验证抑菌物质的性质，对筛选到的目标菌株进行了进一步实验。下列叙述正确的是（　　） 土壤取样→梯度稀释→涂布分离→纯化培养→计数→抑菌实验→性质验证 A．稀释涂布平板法的计数结果通常高于实际活菌数量 B．该实验流程中，平板划线法可替代稀释涂布平板法进行计数 C．筛选芽孢杆菌的培养基，接种后必须先倒平板再高压蒸汽灭菌 D．为验证抑菌物质是否为蛋白质，先用蛋白酶处理目标菌株的培养液，再做抑菌实验 【答案】D 【知识点】培养基的类型及其应用、无菌技术、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、稀释涂布平板法计数时，若两个或多个活菌连在一起，平板上只会形成一个菌落，因此计数结果通常低于实际活菌数量，A错误； B、平板划线法仅能用于微生物的分离纯化，无法统计活菌数量，不能替代稀释涂布平板法进行计数，B错误； C、培养基制备的正确顺序为先高压蒸汽灭菌，再倒平板，若先倒平板再灭菌会造成培养基污染、操作失效，C错误； D、酶具有专一性，蛋白酶可特异性水解蛋白质，若用蛋白酶处理目标菌株的培养液后，抑菌效果消失，即可证明抑菌物质是蛋白质，实验设计合理，D正确。 3．（信阳二模）青霉素能破坏细菌的细胞壁从而杀死细菌。工业上常用产黄青霉菌生产青霉素，发酵过程需要大量氧气。血红蛋白携带氧气能力强，将其引入青霉菌可能提高青霉素产量。下列说法正确的是（　　） A．配制培养基时，除必要营养成分外，还需将pH调至弱碱性 B．接种前的菌种需经扩大培养，目的是增加发酵罐中青霉菌起始数量 C．青霉菌自身产生的青霉素具有杀菌作用，因此培养液无需严格灭菌 D．可将哺乳动物成熟红细胞与青霉菌进行细胞融合，以保障青霉素持续高产 【答案】B 【知识点】培养基的成分及其功能、发酵工程的基本环节 【详解】A、产黄青霉菌属于真菌，培养真菌的培养基需将pH调至酸性，培养细菌时才需将pH调至弱碱性，A错误； B、接种前对菌种进行扩大培养，可获得足量的优质菌种，从而增加发酵罐中青霉菌的起始数量，缩短发酵周期，提高发酵效率，B正确； C、青霉素仅能杀灭细菌，无法杀灭真菌类杂菌及耐药性细菌，杂菌会与青霉菌竞争营养，甚至产生有害物质降低青霉素产量，因此培养液必须严格灭菌，C错误； D、哺乳动物成熟红细胞没有细胞核和核糖体等细胞器，无法持续合成血红蛋白，且二者亲缘关系极远，细胞融合后也难以正常增殖并表达相关性状，无法保障青霉素持续高产，D错误。 4．（郑州二测）东北辣白菜是传统发酵食品，制作时常加入苹果、梨、大蒜、生姜等辅料，入坛中密封发酵。下列叙述正确的是（　　） A．装坛前，需对苹果、梨、大蒜、生姜等辅料进行消毒灭菌 B．发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸和少量CO2使pH降低 C．若发酵坛密封不严，会导致乳酸菌繁殖过快致使辣白菜酸度过高 D．发酵后期，乳酸含量积累到一定程度会反过来抑制乳酸菌的活性 【答案】D 【知识点】泡菜的腌制 【详解】A、辣白菜发酵依赖辅料表面附着的天然乳酸菌，若对辅料消毒灭菌会杀死目的菌种，导致发酵无法正常进行，A错误； B、乳酸菌为严格厌氧细菌，无氧呼吸仅产生乳酸，不生成CO₂，发酵过程pH降低是乳酸积累导致的，B错误； C、乳酸菌是厌氧微生物，密封不严会使氧气进入，抑制乳酸菌的无氧呼吸，导致乳酸菌繁殖减慢，不会造成酸度过高，还可能引发杂菌污染，C错误； D、发酵后期乳酸不断积累，发酵液pH持续下降，当pH超出乳酸菌适宜生存范围时，会反过来抑制乳酸菌的活性，D正确。 5．(安阳预测)豆糁是河南省豫东地区的传统即食发酵食品，以黄豆为主料，经蒸煮、发酵、调味、成型、晾晒等传统工艺制成，根据配料不同，有五香、微辣、麻辣等多种口味。下列叙述错误的是（    ） A．参与制作豆糁的发酵菌种属于混合菌种 B．制作时发酵材料和发酵装置应严格灭菌 C．蒸煮和添加的配料都具有防腐杀菌作用 D．豆糁中含有多种容易消化吸收的有机物 【答案】B 【详解】A、豆糁属于传统发酵食品，多种微生物参与发酵，A正确； B、传统发酵不需要严格灭菌，灭菌会杀死自然存在的发酵菌种，导致无法发酵，B错误； C、蒸煮属于煮沸消毒法，配料中含有葱、姜、蒜等辛辣物质，具有杀菌作用、C正确； D、黄豆经微生物发酵，蛋白质、淀粉被分解为氨基酸、单糖等小分子，更易被人体消化吸收，D正确。 6．（鹤壁一模）腐乳、泡菜、果酒、果醋等发酵食品深受消费者青睐，这些美食的制作都离不开传统发酵技术。下列有关叙述错误的是（　　） A．传统发酵缺乏对菌种的选育，以混合菌种的固体或半固体发酵为主 B．毛霉将豆腐中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，使腐乳味道鲜美 C．制作出的泡菜“咸而不酸”可能是因为食盐浓度过高或发酵温度过低 D．葡萄酒制作完成后，只需要打开瓶盖通入空气即可进行葡萄醋的发酵 【答案】D 【知识点】果酒和果醋的制作原理、腐乳制作的原理、泡菜的腌制 【详解】A、传统发酵技术依赖天然菌种，未进行人工纯化或选育，多采用混合菌群在固体（如腐乳）或半固体（如泡菜）基质中发酵，A正确； B、腐乳制作中，毛霉分泌蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，提升鲜味，B正确； C、泡菜“咸而不酸”是因高浓度食盐抑制乳酸菌活性，或低温降低酶活性，导致乳酸发酵受阻，C正确； D、醋酸发酵需醋酸菌（需氧菌），但直接开盖通入空气易导致杂菌污染及乙醇挥发。正确操作需在酒精发酵后，通入无菌空气并维持30-35℃（非仅通空气），D错误。 故选D。 7．（华大联盟预测）ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种优良的天然食品防腐剂。ε-PL能抑制多种微生物的活性，且在人体内可被分解为赖氨酸。从土壤中分离出能分泌ε-PL的微生物的流程如图所示。ε-PL可使亚甲基蓝褪色，形成透明圈。下列叙述正确的是（    ） A．土样、培养基和接种工具等均需要严格灭菌处理，以防止杂菌污染 B．步骤Ⅰ、Ⅲ的接种方法分别是涂布平板法、平板划线法 C．步骤Ⅲ中应挑选菌落③接种到固体培养基表面培养，进一步筛选出目的菌株 D．若要从丁培养基中收集ε-PL，则采用过滤、沉淀等方法将菌体分离提纯干燥 【答案】B 【知识点】发酵工程的应用、微生物的接种方法、无菌技术 【详解】A、土样中含有目的菌株，不能灭菌，否则会杀死目的菌株，A错误； B、步骤Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的接种方法分别是涂布平板法（先稀释后涂布）、平板划线法（用接种环接种），B正确； C、ε-PL可使亚甲基蓝褪色，故能分泌ε-PL的微生物周围会形成透明圈，透明圈直径越大，分泌ε-PL的量越多，故步骤Ⅲ应挑选菌落①接种到固体培养基表面培养，进一步筛选出目的菌株，C错误； D、产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取，ε-PL是目的菌分泌到胞外的代谢产物，丁培养基是液体发酵培养基，要收集ε-PL，不需要对菌体提纯干燥，D错误。 8．（九师预测）在工业化生产青霉素的过程中，发酵工程发挥了关键作用。已知工业上生产青霉素的主要菌种是产黄青霉。下列叙述正确的是（　　） A．青霉素是产黄青霉的次级代谢产物，从发酵液中提取的青霉素不可直接用于治疗 B．发酵罐中的培养基需要通过灼烧的方式灭菌，该方法可杀死所有微生物及其孢子 C．产黄青霉发酵时需要持续通入无菌氧气以满足其代谢需求 D．通过诱变育种选育高产菌株是提高青霉素产量的唯一措施 【答案】A 【知识点】无菌技术、发酵工程的基本环节、发酵工程的应用 【详解】A、青霉素是典型的次级代谢产物，从发酵液中分离后还需经过多步纯化工艺才能得到符合药用标准的原料药，A正确； B、发酵罐中的培养基需经过高压蒸汽灭菌，目的是杀死所有微生物及其孢子，B错误； C、青霉素由产黄青霉在有氧条件下合成，属于典型的好氧发酵过程。因此，在深层通气式液体发酵中必须不断通入经无菌过滤的空气，保证溶解氧含量，维持菌体正常生长和产物合成，C错误； D、诱变育种是培育高产青霉素菌株的有效方法，但不是唯一方法，如基因工程育种，D错误。 9．（开封二模）乳糖需经乳糖酶分解才能被人体吸收利用。缺少乳糖酶的人摄入乳糖后，易出现腹泻。科研人员筛选生产乳糖酶优良菌种的过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） 注：X-gal为乳糖酶的显色底物，乳糖酶可与无色的X-gal反应产生蓝色物质。 A．对微生物进行纯培养的步骤一般为配制培养基、接种、灭菌、分离和培养 B．菌落直径与蓝色圈直径之比越小，菌落中微生物产生乳糖酶的能力越强 C．图中②接种方法只适合用于筛选微生物，不适合对微生物进行计数 D．乳糖酶属于优良菌种生产的单细胞蛋白，可以有效去除牛奶中的乳糖 【答案】B 【知识点】培养基的类型及其应用、其他微生物的分离与计数 【详解】A、微生物纯培养的正确顺序是配制培养基→灭菌→接种→分离和培养，灭菌必须在接种前进行，否则会杀死接种的微生物，A错误； B、乳糖酶可催化无色X-gal生成蓝色物质，产乳糖酶能力越强，酶的分解范围越大，蓝色圈直径越大。因此菌落直径与蓝色圈直径的比值越小，说明蓝色圈相对越大，微生物产乳糖酶的能力越强，B正确； C、图中经过稀释后接种得到均匀分布的单菌落，该接种方法是稀释涂布平板法，稀释涂布平板法既可以筛选微生物，也可以对微生物进行活菌计数，C错误； D、单细胞蛋白是人工培养的微生物菌体本身，不是微生物产生的酶，D错误。 10．（开封一模）苹果表皮上附着有野生的醋酸菌。可从苹果上筛选优质醋酸菌种，用于苹果醋的制作，筛选过程如图。下列叙述错误的是（    ） A．初筛时，扩大培养需用液体培养基进行振荡培养 B．筛选用的培养基应采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌 C．筛选时产生了透明圈的为“符合要求”的单菌落 D．缺少糖源和氧气时，醋酸菌可将乙醇转化为醋酸 【答案】D 【知识点】果酒和果醋的制作原理、其他微生物的分离与计数 【详解】A、液体培养基能使营养物质与菌体充分接触，有利于微生物对营养物质的充分利用。振荡培养可以增加培养液中的溶氧量，同时使菌体与培养液充分接触，有利于微生物的生长和繁殖。醋酸菌是好氧菌，因此，初筛时，扩大培养需用液体培养基进行振荡培养，A正确； B、筛选用的培养基应采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，这样可以防止杂菌污染获得纯净培养物，B正确； C、产生透明圈可能是因为该菌落产生的醋酸与培养基中碳酸钙发生反应，故初筛时产生了透明圈的菌落为产醋酸的单菌落，C正确； D、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，此时需要充足的氧气，D错误。 故选D。 11．（洛阳检测）青霉素发酵是高耗氧过程，在发酵过程中总有头孢霉素产生，二者是由共同的前体分别经过酶A 和酶B作用后合成，如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．欲获得青霉素，培养基、发酵设备及发酵过程都要严格灭菌 B．发酵结束后，可通过提取、分离和纯化获得所需要的产品 C．为了提高青霉素的产量，可敲除青霉菌株中控制酶B 的基因 D．为了保证发酵过程中高效供氧，可尝试将人血红蛋白基因导入青霉菌 【答案】A 【知识点】无菌技术、发酵工程的基本环节、发酵工程的应用 【详解】A、青霉素发酵利用的是青霉菌的发酵过程，青霉菌属于需氧型微生物。在发酵时，为了防止杂菌污染，培养基、发酵设备都要严格灭菌，但发酵过程不能灭菌，因为灭菌会杀死青霉菌，影响青霉素的产生，A错误； B、发酵结束后，发酵液中含有多种物质，可通过提取、分离和纯化等步骤获得所需要的产品，B正确； C、因为青霉素和头孢霉素有共同前体，分别经酶A和酶B作用合成，敲除青霉菌株中控制酶B的基因，就可阻断头孢霉素合成途径，使前体物质更多用于合成青霉素，从而提高青霉素产量，C正确； D、青霉菌是需氧型微生物，血红蛋白能运输氧气，将血红蛋白基因转入青霉菌中是一种保证发酵过程中高效供氧的思路，所以可以尝试将人血红蛋白基因导入青霉菌，D正确。 12．（新乡三模）人参皂苷是人参中重要的活性成分。研究者利用某种乳酸菌（LGG）转化人参皂苷，工艺包括：菌种的选育、扩大培养、培养基的配制和灭菌、接种、发酵、分离和提纯人参皂苷。下列叙述错误的是（    ） A．利用基因工程处理可获得人参皂苷转化能力更强的乳酸菌种 B．人参原材料、接种工具、培养基和发酵设备等必须使用无菌技术 C．用稀释涂布平板法和血细胞计数板计数法直接统计乳酸菌活菌数 D．LGG接种量过多会因菌体竞争、代谢副产物累积抑制皂苷合成 【答案】C 【详解】A、基因工程可定向改造生物性状，将与人参皂苷转化相关的目的基因导入乳酸菌，可获得转化能力更强的菌种，A正确； B、为避免杂菌污染干扰发酵过程，人参原材料、接种工具、培养基和发酵设备等都需进行无菌处理，严格遵循无菌技术，B正确； C、稀释涂布平板法可直接统计乳酸菌活菌数，但血细胞计数板计数法会同时统计活菌和死菌，无法直接统计活菌数，C错误； D、LGG接种量过多时，大量菌体竞争有限的营养物质，且代谢产生的副产物不断积累，会抑制皂苷的合成，D正确。 13．（许洛平济质量检测）乙醇梭菌可利用钢铁厂尾气中的CO、CO2为无机碳源，H2为还原剂，发酵生产乙醇与单细胞蛋白，流程如图所示；该菌种安全无毒，可用于食品及饲料工业。现代发酵工程正借此朝着智能化、绿色化、高值化转型升级。下列叙述错误的是（　　） A．发酵过程中产生的乙醇和单细胞蛋白都属于乙醇梭菌的次生代谢物 B．利用钢铁厂尾气进行发酵生产，可帮助实现碳中和并减小生态足迹 C．乙醇梭菌是自养厌氧型细菌，发酵过程中适度搅拌可提高发酵速率 D．发酵最终得到的单细胞蛋白可以用作饲料，使家畜、家禽增重加快 【答案】A 【详解】A、初生代谢物是微生物生长繁殖必需的代谢产物，次生代谢物是微生物生长非必需、不是生长繁殖必需的产物。单细胞蛋白本质是乙醇梭菌的菌体，其含有的蛋白质等是菌体生长繁殖必需的物质，属于初生代谢相关产物，只有乙醇属于次生代谢物，A错误； B、该工艺利用钢铁厂废气中的含碳气体生产产品，减少了工业碳排放，固定了碳，有利于实现碳中和，减少人类对环境的影响，减小生态足迹，B正确； C、乙醇梭菌可以利用无机碳源合成自身有机物，且发酵在厌氧条件下进行，因此是自养厌氧型细菌；适度搅拌可以让菌体和原料充分接触，提高原料利用率，进而提高发酵速率，C正确； D、题干明确说明该菌种安全无毒，单细胞蛋白富含蛋白质，可以作为饲料添加剂，促进家畜家禽生长，加快增重，D正确。 14．（豫南名校联考）为初步筛选高产异亮氨酸菌株，研究人员将待测菌接种在琼脂块上，再将琼脂块转接到含有异亮氨酸缺陷型指示菌的平板上，培养后观察琼脂块周围指示菌的生长圈，结果如下图。相关叙述正确的是（　　） A．该筛选原理与抑菌圈法相同，待测菌抑制指示菌的生长 B．培养基以异亮氨酸为唯一氮源，采用湿热灭菌法灭菌 C．接种指示菌时应在酒精灯火焰旁采用平板划线法接种 D．指示菌生长圈越大，待测菌产异亮氨酸的能力越强 【答案】D 【详解】A、抑菌圈法的原理是待测物抑制指示菌生长，表现为琼脂块周围无指示菌生长，本实验是待测菌产生的异亮氨酸促进指示菌生长，二者原理完全不同，A错误； B、若培养基以异亮氨酸为唯一氮源，整个平板的指示菌均可生长，无法区分不同待测菌的产异亮氨酸能力，本实验所用培养基应不含异亮氨酸，B错误； C、接种指示菌需要使其均匀分布在整个平板表面，应采用稀释涂布平板法，平板划线法用于分离单菌落，无法让指示菌均匀铺满平板，C错误； D、指示菌生长圈越大，说明琼脂块中待测菌分泌、扩散到周围的异亮氨酸含量越高，即待测菌产异亮氨酸的能力越强，D正确。 15．（豫南名校联考）精酿啤酒由于更丰富的口感受到消费者的青睐。下图是某精酿啤酒的发酵流程图，相关叙述错误的是（　　） A．可使用赤霉素对大麦进行处理，麦芽粉碎可方便后续的糖化过程 B．加入啤酒花可产生丰富的口感，蒸煮可终止酶的进一步作用 C．回旋沉淀、冷却后加入酵母菌，在发酵罐内进行主发酵 D．发酵后不过滤、不消毒、保留活酵母的精酿啤酒，保质期时间较长 【答案】D 【详解】A、赤霉素可诱导大麦种子合成淀粉酶，无需大麦发芽即可为糖化过程提供淀粉酶，麦芽粉碎可增大反应物接触面积，便于后续糖化反应进行，A正确； B、啤酒花可赋予啤酒特殊的风味和口感，蒸煮时的高温会使酶的空间结构被破坏而变性失活，进而终止酶的进一步作用，B正确； C、回旋沉淀可去除蒸煮产生的残渣，冷却后再加酵母菌是为了避免高温杀死酵母菌，之后酵母菌可在发酵罐内进行主发酵（酒精发酵），C正确； D、不过滤、不消毒且保留活酵母的精酿啤酒中，活酵母会持续进行代谢活动，同时未消毒易滋生杂菌，会导致啤酒更快变质，保质期更短，并非更长，D错误。 第二章：细胞工程 1．（濮阳二模）Ca2+是细胞生命活动的关键离子，在动植物生理及生物技术中参与多种过程。下列叙述错误的是（　　） A．可用高Ca2+-高pH融合法促进植物原生质体融合，进而获得杂交细胞 B．PCR实验中，Ca2+可激活耐高温的DNA聚合酶，保障DNA扩增的高效进行 C．哺乳动物血液中Ca2+浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐等症状 D．用Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【答案】B 【知识点】兴奋在神经元之间的传递、PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、植物体细胞杂交技术 【详解】A、植物原生质体融合的化学诱导方法包含高Ca2+-高pH融合法、PEG融合法等，可促进原生质体融合进而获得杂交细胞，A正确； B、PCR实验中，是Mg2+作为辅因子激活耐高温的DNA聚合酶，保障扩增高效进行，B错误； C、哺乳动物血液中Ca2+可调节神经肌肉兴奋性，浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐症状，C正确； D、基因工程操作中，用Ca2+处理大肠杆菌可使其处于感受态，能够更容易吸收周围环境中的DNA分子，D正确。 2．（濮阳二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶驱动两侧基因转录，研究人员利用Ti质粒构建如图所示基因表达载体，用于检测双向启动子功能。下列叙述错误的是（　　） A．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 B．可通过荧光+蓝色显色双重检测，更准确判断双向启动子是否双向起效 C．双向启动子驱动GUS与LUC转录时，不能使用同一条DNA单链作为模板链 D．为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 【答案】A 【知识点】遗传信息的转录、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，A错误； B、LUC基因表达可产生荧光，GUS基因表达可产生蓝色物质，若两种现象都出现，说明双向启动子两个方向都能启动转录，双重检测可提高判断准确性，B正确； C、双向启动子向两个相反方向驱动转录，转录方向为5′→3′，因此两个基因的模板链一定是不同的DNA单链，不能使用同一条单链作为模板，C正确； D、根据题图分析可知，在不破坏LUC基因前提下，为连入GUS基因，需用Sal I和Age I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，D正确。 3．（郑州二测）某研究团队开发了一种工程化囊泡靶向修复心脏损伤的新技术，流程如图所示，其中血小板的膜具有较好的靶向能力。下列叙述错误的是（　　） A．成纤维细胞能形成iPS细胞，证明其具有全能性 B．血小板膜与囊泡膜的融合体现了生物膜的流动性 C．工程化囊泡的定向输送与受损部位细胞膜或血小板膜上的特定受体有关 D．利用该技术修复受损心脏可以规避免疫排斥，无需使用免疫抑制剂 【答案】A 【知识点】生物膜的流动镶嵌模型、细胞的全能性、干细胞工程 【详解】A、细胞的全能性是指已分化的细胞仍然具有分化为成年动物体内任何一种类型的细胞，进一步形成所有组织或器官甚至个体的潜能。成纤维细胞经诱导形成 iPS 细胞（诱导多能干细胞），不能证明其具有全能性，A错误； B、血小板膜与胞外囊泡膜的融合，依赖于生物膜的结构特点 ——流动性，B正确； C、血小板膜具有靶向受损部位的能力，本质是膜上的特定分子（如蛋白质）能与受损部位细胞膜上的特定受体特异性识别、结合，C正确； D、该技术使用的成纤维细胞来自患者自身，诱导形成的 iPS 细胞、胞外囊泡及工程化囊泡均来源于患者自身，不会引发免疫排斥反应，因此无需使用免疫抑制剂，D正确。 4．（洛阳3月检测）铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一。以铁皮石斛新生营养芽为材料，培养拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验如图所示。下列说法不正确的是（    ） A．铁皮石斛产生的生物碱属于其次生代谢产物 B．过程①诱导新生营养芽变成PLBs的关键是适宜的植物激素和营养条件 C．过程②培养高产细胞系应选择细胞数量/生物碱产量比值大的PLBs D．PLBs重量、光照等因素均会影响生物碱的产量 【答案】C 【知识点】影响植物组织培养的因素、植物细胞工程的实际应用 【详解】A、植物细胞的次生代谢物含量很低，从植物组织提取会大量破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合成途径得到，因此人们期望利用植物细胞培养来获得目标产物，铁皮石斛产生的生物碱属于其次生代谢产物，A正确； B、过程①表示脱分化，脱分化的关键是适宜的植物激素和营养条件，B正确； C、培养高产细胞系时，应该选择生物碱产量/细胞数量比值大的PLBs，因为我们的目的是获得高产生物碱的细胞系，生物碱产量/细胞数量比值大意味着单位细胞数量产生的生物碱多，更符合高产的要求，C错误； D、PLBs重量、光照等因素均会影响生物碱的产量，D正确。 故选C。 5．（洛阳3月检测）科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体—药物偶联物（ADC），以便精准治疗肿瘤，ADC的作用机制如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．单克隆抗体制备过程中需要的抗原来自人特定的肿瘤细胞 B．抗体进入特定的肿瘤细胞导致其裂解死亡 C．ADC能精准治疗特定肿瘤细胞的原理是抗体与抗原的特异性结合 D．药物可能进入肿瘤细胞核并调控基因的表达 【答案】B 【知识点】动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【详解】A、单克隆抗体起靶向运输作用，与肿瘤细胞表面的抗原结合，因此，单克隆抗体制备过程中需要的抗原来自人特定的肿瘤细胞，A正确； B、ADC进入肿瘤细胞后，被溶酶体水解，释放药物，药物导致肿瘤细胞裂解死亡，B错误； C、ADC能精准治疗特定肿瘤细胞的原理是抗体与抗原的特异性结合，C正确； D、ADC进入肿瘤细胞后，被溶酶体水解，释放药物，药物可能进入肿瘤细胞核并调控基因的表达，最终导致肿瘤细胞凋亡，D正确。 6．（郑外模拟）研究者将早期胚胎不同位置的两种细胞a和b置于相同培养液中进行独立培养或混合培养，结果如下图。下列叙述错误的是（　　） A．培养液中通常应加入动物血清 B．细胞a和b来自滋养层细胞 C．独立培养后细胞a和b出现稳定性差异 D．细胞的“命运”可被环境信号改变 【答案】B 【详解】A、动物细胞培养时，培养液中通常应加入动物血清以提供必要的生长因子和营养物质，A正确； B、细胞a和b是早期胚胎中具有分化潜能的细胞，根据其分化方向（肌细胞、神经细胞），它们应来自内细胞团（内细胞团将来发育成胎儿的各种组织），而非滋养层细胞（滋养层将来发育成胎膜和胎盘），B错误； C、在独立培养条件下，细胞a发育为肌肉细胞，细胞b发育为神经细胞，二者出现了形态、功能上的稳定性差异，C正确； D、混合培养时，细胞a的分化方向发生改变（可发育为神经细胞），说明细胞的 “命运” 可被环境信号改变，D正确。 7．（郑外模拟）下列关于中学生物学实验的叙述，错误的是（　　） A．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验中，检测试剂可选用斐林试剂 B．尝试利用乙烯利催熟水果实验中，当溶液pH<3.5时，它会分解释放出乙烯 C．DNA的粗提取与鉴定实验中的提取过程可以不使用离心机 D．观察叶绿体和细胞质的流动实验过程均需保持细胞活性 【答案】B 【详解】A、淀粉酶可水解淀粉产生还原糖（麦芽糖），但不能水解蔗糖，斐林试剂可与还原糖在水浴加热条件下产生砖红色沉淀，能检测两种底物的水解情况，A正确； B、乙烯利在pH<3.5的水溶液中性质稳定，当pH升高时才会分解释放乙烯，选项表述错误，B错误； C、DNA粗提取与鉴定实验中，若无离心机，可将细胞破碎后的混合液静置，取上层清液即可开展后续提取步骤，因此提取过程可以不使用离心机，C正确； D、只有活细胞的细胞质才具有流动性，且叶绿体结构保持完整，因此两个实验均需保持细胞活性，D正确。 8．(安阳预测)科学家将用干细胞培育的人类肠道、肝脏及大脑等“类器官”，直接注入怀孕母鼠的羊膜腔内（充满羊水），这些“类器官”成功“入住”发育中的小鼠胚胎，精准归巢至对应器官（肠、肝、脑），并在小鼠出生后长期稳定存活且发挥功能。下列叙述正确的是（    ） A．与直接注入胚胎相比，注入羊膜腔的伤害性较小 B．培育“类器官”的过程利用了细胞核移植技术 C．“类器官”的培育和移入胚胎都无免疫排斥反应 D．该技术是干细胞的利用，不会涉及伦理问题 【答案】A 【详解】A、该技术是将“类器官”直接注入羊膜腔，而不直接穿刺、损伤胚胎本身，比直接注入胚胎损伤更小，A正确； B、“类器官”由干细胞增殖、分化形成，并未利用细胞核移植技术，B错误； C、胚胎移植无免疫排斥，虽然羊膜腔中有羊水，但“类器官”来源于人类，进入小鼠的羊膜腔内可能发生免疫排斥，C错误； D、该技术将“类器官”引入动物胚胎，形成人-鼠嵌合体，直接涉及生命伦理、物种嵌合、人类基因扩散等重大伦理问题，D错误。 9．（鹤壁一模）iPS细胞在人类疾病治疗方面有广阔的应用前景，用iPS细胞治疗镰状细胞贫血的过程如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．①过程往往需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理获得的组织 B．②过程需用Ca2+处理体细胞，以利于其吸收特定的DNA分子 C．③④过程需在含一定CO2的环境中进行，以维持培养液的pH D．用iPS细胞治疗镰状细胞贫血理论上不会发生免疫排斥反应 【答案】B 【知识点】基因诊断和基因治疗、干细胞工程、动物细胞培养技术、基因治疗 【详解】A、欲将动物组织制成细胞悬液，形成单细胞，需要用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等进行处理，A正确； B、②过程为将目的基因导入动物细胞，可采用显微注射法，将目的基因导入大肠杆菌细胞才采用Ca2+处理法，B错误； C、③④过程为动物细胞培养的过程，动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是维持培养液的pH，C正确； D、iPS 细胞一般是将来源于患者自身的细胞诱导形成的，移植回病人体内，理论上可避免免疫排斥反应，D正确。 故选B。 10．（九师预测）髓系细胞触发受体2（TREM2）是一种免疫抑制受体，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。TREM2抗体药物有望提高肿瘤免疫疗法的疗效。如图为TREM2单克隆抗体的制备流程图。下列叙述正确的是（　　） A．制备单克隆抗体过程中需对细胞进行至少三次筛选 B．经步骤②诱导融合后的细胞都能分泌TREM2抗体 C．诱导动物细胞融合不同于诱导植物细胞融合的方法是灭活病毒诱导 D．TREM2单克隆抗体具有准确识别抗原细微差异又可无限增殖的特点 【答案】C 【知识点】动物细胞融合与单克隆抗体的制备、植物体细胞杂交技术、动物细胞培养技术 【详解】A、单克隆抗体制备中至少需要两次筛选：第一次用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，A错误； B、诱导融合后会得到未融合细胞、同种细胞融合细胞、杂交瘤细胞等多种细胞，只有筛选后得到的特定杂交瘤细胞才能分泌TREM2抗体，B错误： C、诱导植物原生质体融合的方法为物理法、化学法，灭活病毒诱导是动物细胞融合特有的方法，这是二者的区别，C正确； D、无限增殖是杂交瘤细胞的特点，单克隆抗体是蛋白质，不具备增殖能力，D错误。 11．（九师预测）在胚胎工程研究中，受精卵培养至囊胚后分三组处理：甲组直接移植：乙组体外暴露于生长因子液后移植：丙组在信号分子抑制剂中孵育后移植。结果甲组和乙组部分胚胎成功着床（胚胎和母体建立物质交换）并发育，丙组全部着床失败。下列叙述正确的是（　　） A．甲组结果说明胚胎着床不依赖于外界信号分子，完全自主 B．若乙组着床率高于甲组，可能因生长因子诱导基因突变增强适应性 C．丙组无法着床，表明信号通路正常激活是胚胎与子宫妊娠关系的前提 D．着床仅取决于受体子宫状态，三组差异均由受体个体差异导致 【答案】C 【知识点】胚胎发育、胚胎的体外培养、胚胎移植技术 【详解】A、甲组直接移植到母体后，胚胎仍可获得母体提供的信号分子，胚胎着床不是完全自主过程，A错误； B、本实验中生长因子是作为信号分子调节胚胎生理活动，不是诱导基因突变增强适应性；基因突变具有低频性，不可能是乙组着床率更高的原因，B错误； C、丙组用信号分子抑制剂处理后，全部着床失败，说明信号通路正常激活，是胚胎和母体建立妊娠关系（着床）的前提，C正确； D、本实验三组的差异来自对胚胎的不同处理，且着床依赖胚胎和受体子宫双方的状态，不是仅由受体决定，D错误。 12．（开封三模）银缕梅是我国特有的珍稀濒危物种，被称为“被子植物的活化石”。为缓解银缕梅濒危现状，研究人员以银缕梅带芽茎段为外植体，利用植物组织培养技术成功建立了组培快繁体系，其大致流程如图所示（其中②为诱导生根）。下列叙述错误的（    ） A．该植物组培快繁的流程是①→③→②→④→⑤→⑥ B．②过程使用的培养基中生长素/细胞分裂素的值应大于1 C．④和⑤过程除提供必要营养物质、植物激素外，还需提供一定光照 D．⑥为移栽过程，移栽前需用流水清洗掉根部的培养基，提高成活率 【答案】A 【详解】A、植物组织培养的正确流程为外植体①→脱分化形成愈伤组织③→再分化出芽④→诱导生根②→组培苗生长⑤→移栽⑥，A错误； B、生长素与细胞分裂素的比值大于1时有利于根的分化、抑制芽的形成，②为诱导生根过程，培养基中该比值应大于1，B正确； C、④为丛芽分化阶段、⑤为诱导生根阶段，这两个阶段需要光照诱导叶绿素合成、维持光合作用，因此除营养物质和植物激素外，还需提供一定光照，C正确； D、⑥为移栽过程，根部残留的培养基易滋生微生物导致烂根，用流水清洗根部培养基可减少污染，提高移栽成活率，D正确。 13．（洛阳检测）传统中药材铁皮石斛富含某些糖类和生物碱，可以用来提取药物，近年来需求日益增加。利用植物组织培养技术获得试管苗已形成一定规模，有助于解决野生资源短缺问题。下列叙述正确的是（    ） A．进行再分化的培养基不含有机碳源 B．培养基先分装到锥形瓶，封口后用干热灭菌法灭菌 C．植物体细胞具有全能性，但生殖细胞不具有全能性 D．培养基中生长素含量大于细胞分裂素时，有利于诱导愈伤组织生根 【答案】D 【知识点】无菌技术、植物组织的培养及基本过程、影响植物组织培养的因素 【详解】A、植物组织培养中，再分化阶段培养基需添加有机碳源（如蔗糖）作为能量来源，A错误； B、培养基灭菌应采用高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌），干热灭菌仅适用于玻璃器皿等耐高温干燥物品，B错误； C、植物体细胞和生殖细胞（如花粉）均具有全能性，均可通过组织培养发育成完整植株，C错误； D、生长素与细胞分裂素的比例调控器官分化：生长素含量高于细胞分裂素时，促进生根；细胞分裂素含量较高时，促进生芽。该选项描述符合激素调控原理，D正确。 故选D。 14．（新乡三模）利用膀胱生物反应器生产人血清白蛋白，基本流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．操作②是对早期胚胎进行移植，移植前需对受体母猪进行超数排卵处理 B．膀胱生物反应器不受性别及发育限制，产量一定高于乳腺生物反应器 C．若操作①和操作②成功，则操作③就能从尿液中检测到人血清白蛋白 D．操作①使用膀胱中特异表达基因的启动子可避免对其他组织产生影响 【答案】D 【详解】A、操作②是胚胎移植，移植前需要对受体母猪进行同期发情处理，目的是让供体和受体的生理状态一致，为胚胎着床提供相同的生理环境；而超数排卵处理是针对供体母猪的，用来获得更多的卵母细胞，A错误； B、膀胱生物反应器确实不受性别及发育阶段限制，相比乳腺生物反应器只能在雌性成体动物泌乳期发挥作用有优势，产量会受到基因表达效率、个体健康状况等多种因素影响，不能直接判定膀胱生物反应器产量更高，B错误； C、操作①是将目的基因导入受精卵，操作②是胚胎移植获得转基因个体，但只有当目的基因在膀胱上皮细胞成功表达时，才能从尿液中检测到人血清白蛋白，仅仅操作成功不代表目的基因一定在特定组织顺利表达，C错误； D、操作①使用膀胱中特异表达基因的启动子，能够驱动目的基因只在膀胱组织中表达，避免在其他组织中表达产生不必要的影响，这是利用特异性启动子实现基因定向表达的典型应用，D正确。 15．（豫南名校联考）精酿啤酒由于更丰富的口感受到消费者的青睐。下图是某精酿啤酒的发酵流程图，相关叙述错误的是（　　） A．可使用赤霉素对大麦进行处理，麦芽粉碎可方便后续的糖化过程 B．加入啤酒花可产生丰富的口感，蒸煮可终止酶的进一步作用 C．回旋沉淀、冷却后加入酵母菌，在发酵罐内进行主发酵 D．发酵后不过滤、不消毒、保留活酵母的精酿啤酒，保质期时间较长 【答案】D 【详解】A、赤霉素可诱导大麦种子合成淀粉酶，无需大麦发芽即可为糖化过程提供淀粉酶，麦芽粉碎可增大反应物接触面积，便于后续糖化反应进行，A正确； B、啤酒花可赋予啤酒特殊的风味和口感，蒸煮时的高温会使酶的空间结构被破坏而变性失活，进而终止酶的进一步作用，B正确； C、回旋沉淀可去除蒸煮产生的残渣，冷却后再加酵母菌是为了避免高温杀死酵母菌，之后酵母菌可在发酵罐内进行主发酵（酒精发酵），C正确； D、不过滤、不消毒且保留活酵母的精酿啤酒中，活酵母会持续进行代谢活动，同时未消毒易滋生杂菌，会导致啤酒更快变质，保质期更短，并非更长，D错误。 第三章：基因工程与蛋白质工程 1．（濮阳二模）Ca2+是细胞生命活动的关键离子，在动植物生理及生物技术中参与多种过程。下列叙述错误的是（　　） A．可用高Ca2+-高pH融合法促进植物原生质体融合，进而获得杂交细胞 B．PCR实验中，Ca2+可激活耐高温的DNA聚合酶，保障DNA扩增的高效进行 C．哺乳动物血液中Ca2+浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐等症状 D．用Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【答案】B 【知识点】兴奋在神经元之间的传递、PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、植物体细胞杂交技术 【详解】A、植物原生质体融合的化学诱导方法包含高Ca2+-高pH融合法、PEG融合法等，可促进原生质体融合进而获得杂交细胞，A正确； B、PCR实验中，是Mg2+作为辅因子激活耐高温的DNA聚合酶，保障扩增高效进行，B错误； C、哺乳动物血液中Ca2+可调节神经肌肉兴奋性，浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐症状，C正确； D、基因工程操作中，用Ca2+处理大肠杆菌可使其处于感受态，能够更容易吸收周围环境中的DNA分子，D正确。 2．（濮阳二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶驱动两侧基因转录，研究人员利用Ti质粒构建如图所示基因表达载体，用于检测双向启动子功能。下列叙述错误的是（　　） A．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 B．可通过荧光+蓝色显色双重检测，更准确判断双向启动子是否双向起效 C．双向启动子驱动GUS与LUC转录时，不能使用同一条DNA单链作为模板链 D．为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 【答案】A 【知识点】遗传信息的转录、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，A错误； B、LUC基因表达可产生荧光，GUS基因表达可产生蓝色物质，若两种现象都出现，说明双向启动子两个方向都能启动转录，双重检测可提高判断准确性，B正确； C、双向启动子向两个相反方向驱动转录，转录方向为5′→3′，因此两个基因的模板链一定是不同的DNA单链，不能使用同一条单链作为模板，C正确； D、根据题图分析可知，在不破坏LUC基因前提下，为连入GUS基因，需用Sal I和Age I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，D正确。 3．（郑州二测）下列有关生物学实验或探究实践的叙述，错误的是（　　） A．利用甲紫溶液对洋葱根尖分生区细胞的染色体染色后需用清水进行漂洗 B．“探究抗生素对细菌的选择作用”时，要从抑菌圈边缘的菌落上挑取细菌 C．常采用记名计算法和目测估计法统计土壤中小动物类群的物种相对数量 D．从土壤中分离分解尿素的细菌时，需以尿素作为唯一氮源的选择培养基 【答案】A 【知识点】有丝分裂实验、自然选择与适应的形成、群落的物种组成以及丰富度的相关探究实验、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【详解】A、观察洋葱根尖分生区细胞有丝分裂的实验流程为解离→漂洗→染色→制片，漂洗需在染色前完成，作用是洗去解离液，避免解离过度且便于碱性染料染色；染色后用清水漂洗会洗去染色体上结合的甲紫染液，无法正常观察染色体，A错误； B、“探究抗生素对细菌的选择作用”实验中，抑菌圈边缘是接触低浓度抗生素后仍存活的抗药性细菌，从此处挑取细菌可进一步验证抗生素的定向选择作用，B正确； C、统计土壤中小动物类群的物种相对数量时，常用记名计算法（适用于个体大、数量少的类群）和目测估计法（适用于个体小、数量多的类群），C正确； D、分离分解尿素的细菌的选择原理是：只有能合成脲酶分解尿素获取氮源的细菌可在尿素为唯一氮源的培养基上存活，其他微生物因缺乏氮源无法生长，因此需使用该类选择培养基筛选，D正确。 4．（郑外模拟）下列关于中学生物学实验的叙述，错误的是（　　） A．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验中，检测试剂可选用斐林试剂 B．尝试利用乙烯利催熟水果实验中，当溶液pH<3.5时，它会分解释放出乙烯 C．DNA的粗提取与鉴定实验中的提取过程可以不使用离心机 D．观察叶绿体和细胞质的流动实验过程均需保持细胞活性 【答案】B 【详解】A、淀粉酶可水解淀粉产生还原糖（麦芽糖），但不能水解蔗糖，斐林试剂可与还原糖在水浴加热条件下产生砖红色沉淀，能检测两种底物的水解情况，A正确； B、乙烯利在pH<3.5的水溶液中性质稳定，当pH升高时才会分解释放乙烯，选项表述错误，B错误； C、DNA粗提取与鉴定实验中，若无离心机，可将细胞破碎后的混合液静置，取上层清液即可开展后续提取步骤，因此提取过程可以不使用离心机，C正确； D、只有活细胞的细胞质才具有流动性，且叶绿体结构保持完整，因此两个实验均需保持细胞活性，D正确。 5．（九师预测）在工业化生产青霉素的过程中，发酵工程发挥了关键作用。已知工业上生产青霉素的主要菌种是产黄青霉。下列叙述正确的是（　　） A．青霉素是产黄青霉的次级代谢产物，从发酵液中提取的青霉素不可直接用于治疗 B．发酵罐中的培养基需要通过灼烧的方式灭菌，该方法可杀死所有微生物及其孢子 C．产黄青霉发酵时需要持续通入无菌氧气以满足其代谢需求 D．通过诱变育种选育高产菌株是提高青霉素产量的唯一措施 【答案】A 【知识点】无菌技术、发酵工程的基本环节、发酵工程的应用 【详解】A、青霉素是典型的次级代谢产物，从发酵液中分离后还需经过多步纯化工艺才能得到符合药用标准的原料药，A正确； B、发酵罐中的培养基需经过高压蒸汽灭菌，目的是杀死所有微生物及其孢子，B错误； C、青霉素由产黄青霉在有氧条件下合成，属于典型的好氧发酵过程。因此，在深层通气式液体发酵中必须不断通入经无菌过滤的空气，保证溶解氧含量，维持菌体正常生长和产物合成，C错误； D、诱变育种是培育高产青霉素菌株的有效方法，但不是唯一方法，如基因工程育种，D错误。 6．（适应性演练）Noxa是一种促凋亡蛋白。为构建表达Noxa的工程菌，现利用PCR技术将Noxa基因连接在ClyA基因的下游，构建ClyA-Noxa融合基因，并插入P载体。两个基因及四条引物如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．为方便构建融合基因，R1和F2引物设计时需要引入一定长度的互补序列 B．为保证插入P载体的准确性，F1和R2引物设计时应引入不同的酶切位点 C．为高效准确构建含ClyA-Noxa融合基因的表达载体，需至少使用4种限制酶 D．为筛选成功转化后的工程菌，可以使用F1和R2的引物组合进行PCR鉴定 【答案】C 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【详解】A、利用重叠PCR构建融合基因时，ClyA的下游引物R1和Noxa的上游引物F2设计互补序列后，两个基因的PCR产物可通过互补序列拼接，进而得到完整的ClyA-Noxa融合基因，A正确； B、在融合基因的两端引物F1（上游）和R2（下游）引入不同的酶切位点，酶切后融合基因的两端黏性末端不同，可保证融合基因定向正确插入载体，B正确； C、仅需在融合基因的两端引入2种不同的酶切位点，用这2种限制酶分别切割融合基因和载体，即可完成表达载体构建，不需要至少4种限制酶，C错误； D、若工程菌成功转入融合基因，F1（结合ClyA上游）和R2（结合Noxa下游）的引物组合可以扩增出对应大小的融合基因条带，若未成功转化则无法扩增出目的条带，因此可用于鉴定，D正确。 7．（新乡三模）利用膀胱生物反应器生产人血清白蛋白，基本流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．操作②是对早期胚胎进行移植，移植前需对受体母猪进行超数排卵处理 B．膀胱生物反应器不受性别及发育限制，产量一定高于乳腺生物反应器 C．若操作①和操作②成功，则操作③就能从尿液中检测到人血清白蛋白 D．操作①使用膀胱中特异表达基因的启动子可避免对其他组织产生影响 【答案】D 【详解】A、操作②是胚胎移植，移植前需要对受体母猪进行同期发情处理，目的是让供体和受体的生理状态一致，为胚胎着床提供相同的生理环境；而超数排卵处理是针对供体母猪的，用来获得更多的卵母细胞，A错误； B、膀胱生物反应器确实不受性别及发育阶段限制，相比乳腺生物反应器只能在雌性成体动物泌乳期发挥作用有优势，产量会受到基因表达效率、个体健康状况等多种因素影响，不能直接判定膀胱生物反应器产量更高，B错误； C、操作①是将目的基因导入受精卵，操作②是胚胎移植获得转基因个体，但只有当目的基因在膀胱上皮细胞成功表达时，才能从尿液中检测到人血清白蛋白，仅仅操作成功不代表目的基因一定在特定组织顺利表达，C错误； D、操作①使用膀胱中特异表达基因的启动子，能够驱动目的基因只在膀胱组织中表达，避免在其他组织中表达产生不必要的影响，这是利用特异性启动子实现基因定向表达的典型应用，D正确。 8．（豫南名校联考）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠P蛋白基因的一端，如图1所示。随机挑取5个品系细胞通过PCR验证GFP的导入情况，结果如图2所示。据此推测在进行PCR扩增时，所选择的引物为（　　） A．F1，R1 B．F2，R1 C．F1，R2 D．F2，R2 【答案】A 【详解】结合图1和图2推测，P-GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，未插入GFP基因则电泳后的DNA片段较小，5个品系细胞中有的只扩增出小片段或大片段，有的两种片段均有，应选择图1中的引物组合是F1、R1，A正确，BCD错误。 故选A。 第四章：基因工程大题专练 1．（许洛平济质量检测）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为研究纤毛相关蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可显示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒，如图所示。 回答下列问题： (1)在选择合适的质粒构建载体时，该质粒需具备的基本条件有_______（答出2点即可）。 (2)为保证将融合片段M完整导入载体Y，需要选用EcoR V来切割载体和目的基因。连接载体和目的基因时，需要用_______（填“E.coli”或“T4”）DNA连接酶来保证高效连接。用PCR检测融合片段M是否正确连接时需选用的引物是_______。 (3)经鉴定M片段已正确连接，但因采用平末端连接方式，接头处易出现碱基缺失或插入。为确保M及连接处序列正确，需要对Y-M连接处进行测序，结果如图所示。显示出正确结果的应该是序列________填写序列编号），原因是_______。 (4)为检测蛋白质X在细胞中的定位，科学家使用对照质粒Y-GFP（仅表达GFP，可使整个细胞散发荧光）与实验质粒Y-M来进行实验。请写出实验设计思路_______。 【答案】(1)具有一至多个限制酶切割位点；能自我复制；具有标记基因 (2) T4 a和b (3) Q4 Q4中含有HindⅢ和EcoR V的识别序列 (4)将对照质粒Y-GFP与实验质粒Y-M分别导入细胞，检测细胞内荧光的分布位置 【详解】（1）基因工程中作为载体的质粒需要满足的核心条件为具有一个或多个限制酶切割位点，便于插入目的基因；具有标记基因，便于筛选导入重组质粒的受体细胞（或能在宿主细胞中稳定存在并自主复制，答出任意2点即可）。 （2）EcoR V切割产生平末端，E.coli DNA连接酶连接平末端的效率要远低于T4 DNA连接酶，因此选T4 DNA连接酶；要检测融合片段M是否正确连接到载体上，需要一对引物分别结合载体（插入位点上游的引物a）和M片段（方向相反的引物b），只有正确连接才能扩增出目的片段，因此选引物a和引物b。 （3）载体原有顺序是HindⅢ→EcoRV→BamHⅠ，M插入EcoRV位点后，HindⅢ下游仍保留EcoRV的序列GATATC，只有Q4符合序列要求，同时平末端连接不增减碱基能保证融合蛋白的阅读框正确。 （4）本实验通过融合蛋白的荧光示踪X的位置，将对照质粒Y-GFP与实验质粒Y-M分别导入细胞，检测细胞内荧光的分布位置，遵循对照原则设计实验即可。 2．（新乡三模）某患儿因CPS1基因中一个碱基G突变为碱基A，导致肝细胞无法合成有活性的CPS1酶，尿素循环受阻，血氨蓄积引发脑损伤。研究人员利用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）修复该突变，使患儿血氨水平恢复正常。如图所示，ABE核心组件包含两部分：①针对CPS1基因突变位点的向导RNA（gRNA）；②由腺苷脱氨酶（TadA）与Cas9缺口酶（nCas9）融合而成的ABE蛋白。回答下列问题。 (1)gRNA能够精准定位CPS1基因突变位点的分子基础是_________________。 (2)nCas9能精准识别并切割缺陷基因，其作用原理与基因工程中的________酶相似，该酶的作用特点是_______________。TadA将致病碱基A脱氨转化I，细胞修复系统将I替换为G，完成A→G的精准修复。 (3)若要检测治疗是否成功，可提取患儿肝脏细胞的总RNA，通过________技术检测CPS1基因是否转录；还可检测血液中氨及有害化合物含量，若含量__________，则说明编辑有效。 (4)研究者采用一定的措施将ABE mRNA和gRNA送入肝细胞，ABE mRNA在肝细胞内翻译出ABE蛋白启动碱基编辑，修复完成后，mRNA和gRNA会被自然降解。与通过病毒载体将正常CPS1基因直接导入患者体内的基因治疗相比，这种修复方法的优点是_______________（答出2点）。 【答案】(1)gRNA识别并与靶基因序列结合时，遵循碱基互补配对原则，能精准定位致病突变位点 (2) 限制 识别DNA分子的特定核苷酸序列，并使特定部位的磷酸二酯键断开 (3) PCR 下降（或恢复至正常） (4)精确修复；不会引入外源基因，安全性更高；降低免疫排斥与基因整合风险 【详解】（1）gRNA 的核心功能是 “导航”，其原理是利用自身的向导序列，gRNA识别并与靶基因序列结合时，遵循碱基互补配对原则，能精准定位致病突变位点，这是 CRISPR 系统精准识别目标 DNA 的分子基础。 （2）nCas9 是 Cas9 的变体，只能在特定位置切割 DNA 单链（形成缺口），它和基因工程中的限制性核酸内切酶（限制酶）一样，都具有序列特异性识别和切割 DNA的能力。限制酶的核心特点： 能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使特定部位的磷酸二酯键断开。 （3）转录的产物是 mRNA，因此要检测 CPS1 基因是否转录，需要提取细胞总 RNA，通过逆转录 PCR：先将 mRNA 逆转录为 cDNA，再通过 PCR 扩增目标序列，以此判断 mRNA 是否存在，即基因是否转录。 题干中提到，突变导致 CPS1 酶失活、尿素循环受阻、血氨蓄积；若编辑有效，CPS1 酶恢复活性，尿素循环正常，血氨会被正常代谢，因此血液中氨及有害化合物含量会下降。 （4）精准修复突变，不引入外源基因：ABE 直接对原有的 CPS1 基因进行单碱基修正，不需要额外导入外源正常基因，避免了外源基因插入基因组可能导致的插入突变、原癌基因激活等风险； 安全性更高，免疫风险低：使用 mRNA 和 gRNA 递送，它们会被细胞自然降解，不会整合到基因组中，降低了病毒载体可能引发的免疫排斥反应和基因整合风险。 3．（适应性演练）培育抗穗发芽小麦品种对保障国家粮食安全具有重要意义。节节麦是普通小麦基因组的供体种。研究者筛选到抗穗发芽节节麦T093，将其与小麦品种W018杂交，子代与W018多次回交，构建了渗入节节麦基因的小麦染色体片段渗入系，挖掘出与种子休眠相关的候选基因P。回答下列问题： (1)与W018相比，渗入系小麦的遗传多样性____（填“增加”或“减少”）。 (2)在筛选抗穗发芽育种材料的过程中，研究人员测定了W018和杂交后代H495的相关指标，结果如图1所示。H495的抗穗发芽能力____（填“高于”或“低于”）W018，可能的机制为____。 (3)Taq酶会在PCR产物的3＇端添加单个腺嘌呤脱氧核苷酸。利用PCR扩增基因P，扩增产物与pMD19-T载体（图2）构建重组质粒时，____（填“需要”或“不需要”）利用限制酶剪切目的基因。 (4)不同来源基因P的碱基差异如图3所示。密码子的简并性主要集中在第三位碱基。相较于W018，推测H495的DNA序列中最有可能引起氨基酸改变的位点是____bp。H495中基因P的碱基变化可能是由T093的基因渗入造成，与穗发芽抗性差异有关，判断的依据是____。 【答案】(1)增加 (2) 高于 H495中基因P的表达量高于W018，促进休眠，提高抗穗发芽能力 (3)不需要 (4) 442 H495中基因P的碱基与T093相同，而与W018不同 【知识点】遗传信息的翻译、基因突变、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【详解】（1）渗入系小麦是将节节麦基因渗入到小麦品种W018中得到的，引入了新的基因，所以与W018相比，渗入系小麦的遗传多样性增加。 （2）由图1可知，H495种子萌发初期发芽率低于W018，所以H495的抗穗发芽能力高于W018，同时，图1中显示H495的P基因相对表达量高于W018，由此推测其可能的机制为H495中基因P的表达量高于W018，促进休眠，提高抗穗发芽能力。 （3）因为Taq酶会在PCR产物的3'端添加单个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以利用PCR扩增基因P后，扩增产物的3'端有单个腺嘌呤脱氧核苷酸，而pMD19-T载体上有胸腺嘧啶脱氧核苷酸，它们可以通过碱基互补配对连接，因此在构建重组质粒时，不需要利用限制酶剪切目的基因。 （4）相较于W018，H495的DNA序列中834bp、1476bp、1995bp、2535bp位点的碱基都是3的倍数，由于密码子简并性主要体现在第三位碱基，这些位置的突变更可能是同义突变，不改变氨基酸，而442bp的位点是3的倍数还多1，属于下一个氨基酸的第一位，所以该位点变化，最可能引起氨基酸改变。判断H495中基因P的碱基变化与穗发芽抗性差异有关的依据是H495中基因P的碱基与T093相同，而与W018不同。 4．（洛阳检测）CART 蛋白参与摄食和体重调节、内分泌调节等相关生理功能，研究者把牛CART基因和萤火虫的荧光素酶基因(LUC基因)拼接成融合基因，融合基因中LUC基因在前， CART基因在后；图甲是融合基因放大图，图乙是大肠杆菌质粒，回答以下问题： (1)据图甲，利用PCR技术扩增融合基因，左侧和右侧引物序列应分别是____和____。 (2)根据图乙载体的结构，为了使扩增后的融合基因能和载体进行正确连接形成重组DNA分子，并能按正确方向转录，利用PCR技术扩增融合基因时还需要在融合基因左侧引物5’端添加限制酶____的识别序列，另一引物5’端添加限制酶____的识别序列。 (3)用融合蛋白基因两端的序列做引物进行PCR可检测融合蛋白基因是否插人大肠杆菌的质粒，该过程所用的模板是____，若导入了融合蛋白基因则实验结果是____。推测把 CART基因和LUC基因拼接成融合基因的目的是____。 【答案】(1) 5'-TCTGTTGAAT-3' 5'-CTTGGATGAT-3' (2) MunI XmaI (3) 导入重组质粒的大肠杆菌的基因组DNA 有 PCR产物(电泳时有对应条带) (给受体菌添加荧光素后)根据荧光强度判断CART基因在受体菌内是否表达及表达强度。 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR引物需与模板链反向互补，且延伸方向为5'→3'，需精准匹配模板序列，图甲左侧模板链序列为 “HO-AGACAACTTA”，反向互补序列为 “TCTGTTGAAT”，按引物5'→3'书写规则，左侧引物为5'-TCTGTTGAAT-3'。 右侧模板链序列为 “ATCATCCAAG”，反向互补序列为 “CTTGGATGAT”，同理右侧引物为5'-CTTGGATGAT-3'。 （2）图乙质粒中，启动子与终止子之间的有效酶切位点为MunI和XmaI，二者切割方向与转录方向一致，可避免基因反向插入。融合基因左侧需靠近质粒启动子，对应酶切位点为MunI；右侧需靠近终止子，对应酶切位点为XmaI，故分别在左侧引物5’端添加MunI识别序列，右侧引物5’端添加XmaI识别序列。 （3）PCR检测的是融合基因是否插入质粒，而质粒已导入大肠杆菌，故模板需包含重组质粒，即导入重组质粒的大肠杆菌的基因组DNA（含质粒DNA）。若质粒中插入融合基因，引物可特异性结合并扩增，电泳时会出现与融合基因长度对应的条带，即有PCR 产物（电泳时有对应条带）。LUC基因（荧光素酶基因）表达产物可发出荧光，与CART基因拼接后，荧光强度可反映CART基因的表达情况，故目的是（给受体菌添加荧光素后）根据荧光强度判断CART基因在受体菌内是否表达及表达强度 。 5．（开封一模）甲醛是一种来源广泛的挥发性有机污染物，具有强烈的致癌和致畸作用，可利用微生物降解甲醛来治理甲醛污染，具有高效、环保、无二次污染等优点。下表为相关限制酶的识别序列及酶切位点，下图为培育转甲醛分解基因大肠杆菌的过程示意图。回答下列问题： 限制酶 识别序列及酶切位点 限制酶 识别序列及酶切位点 MboI 5'…↓GATC…3' SacI 5′…GAGCT↓C…3' SnaBI 5′…TAC↓GTA…3' BamHI 5'…G↓GATCC…3' (1)培养大肠杆菌的培养基需加入____让培养基呈固体状态；培养基需为目标细菌提供的营养包括水、无机盐、______。 (2)可利用PCR技术扩增甲醛分解基因，PCR技术中引物的作用是_______，故应选择图中引物_____来扩增甲醛分解基因。 (3)为保证甲醛分解基因与载体的正向连接，在设计PCR引物时，应在所选引物的_____（填“3'”或“5'’”）端添加相应限制酶的识别序列，左端和右端引物相应位置需要依次添加限制酶________的识别序列。 (4)利用图中所给的信息设计实验筛选未导入质粒、导入空质粒（不含目的基因）和导入重组质粒（含目的基因）的受体菌，写出实验设计思路并预期实验结果_______。 【答案】(1) 琼脂 碳源和氮源 (2) 引导DNA聚合酶从引物的3'端开始合成DNA链 b和c (3) 5' SacI 、SnaBI (4)把受体大肠杆菌接种在含有新霉素的培养基上即可，未导入质粒的大肠杆菌不能形成菌落，黄色菌落为导入空质粒的大肠杆菌，白色菌落为导入重组质粒的大肠杆菌 【知识点】目的基因的检测与鉴定、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程、培养基的成分及其功能 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）琼脂是凝固剂，所以培养大肠杆菌的培养基需加入琼脂让培养基呈固体状态；培养基需为目标细菌提供的营养包括水、无机盐、碳源和氮源。 （2）引物是一段与待扩增目的DNA序列互补的核苷酸片段，引物的主要作用是引导DNA聚合酶从引物的3'端开始复制DNA链‌‌；引物与模板链的3'端结合，PCR为DNA的体外复制，两条链均充当模板，因此需要图中引物b和引物c来扩增甲醛分解基因。 （3）为保证甲醛分解基因与载体的正向连接，一般需要两种限制酶来切割，由于基因转录的方向从右向左，转录时从模板链的3'端到5'端，因此上链为模板链，MboI可以识别BamHI的识别序列会将标记基因破坏；而且为保证正确连接需要注意引物b的5’端需引入SacI，引物c的5‘端需引入SnaBI。 （4）结合图示信息可知，新霉素抗性基因为标记基因，甲醛分解酶基因为目的基因，而mlacZ位于启动子和终止子之间，若插入目的基因后，mlacZ会被破坏，而mlacZ的表达产物会使细胞呈黄色，否则呈白色，所以筛选未导入质粒、导入空质粒（不含目的基因）和导入重组质粒（含目的基因）的受体菌，可在培养基中加入新霉素，由于质粒上有新霉素抗性基因，未导入质粒的大肠杆菌不能形成菌落，长出的黄色菌落为导入空质粒的大肠杆菌，白色菌落为导入重组质粒的大肠杆菌。 6．（开封三模）降钙素是甲状腺滤泡旁细胞分泌的一种激素，可与破骨细胞表面受体结合，抑制破骨细胞增殖，有效治疗骨质疏松症。为降低生产成本，研究人员利用基因工程技术将鲑鱼降钙素（sCT）基因与降钙素基因相关肽（CGRP）基因连接成融合基因，在DNA连接酶的作用下连接到质粒上，构建出重组质粒，经农杆菌介导法转化到生菜中，进而利用植物细胞培养工厂化生产sCT和CGRP。sCT基因、CGRP基因和质粒的结构、限制酶的识别序列及切割位点如图所示。 (1)图中的CaMV35S和AMV均能在生菜不同细胞中高效、持续表达且驱动相关基因的____________过程。CaMV35S和AMV二者属于_____（填“诱导型”或“组成型”）启动子。 (2)第一步，利用PCR技术将sCT基因与CGRP基因连接成融合基因，但需要给引物1添加的限制酶识别序列是5′-___________-3′。PCR反应体系中常需加入一定量的Mg2+，目的是____________。扩增过程中，每次循环包括_______三步。 (3)第二步，将构建的融合基因导入质粒的T-DNA片段，需要用到的限制酶是______（填种类）。用含四环素的普通培养基____（填“能”或“不能”）筛选出成功转化重组质粒的菌株，理由是____________。 (4)利用植物细胞培养技术工厂化生产sCT与CGRP主要是通过提供促进细胞生长的条件来____________，进而提高产量。 【答案】(1) 转录 组成型 (2) TCTAGA 激活耐高温的DNA聚合酶 变性、复性和延伸 (3) EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 不能 普通质粒和重组质粒均含四环素抗性基因，均能在含四环素的培养基上存活 (4)扩大细胞数量并提高目的基因的表达水平 【详解】（1）CaMV35S、AMV都是启动子，作用是驱动基因的转录。CaMV35S、AMV能在生菜不同细胞中高效、持续表达，属于组成型启动子。 （2）由于CGRP基因中含有限制酶Spe I的识别序列，不能在引物1的5'端添加限制酶Spe Ⅰ的识别序列，但由于限制酶EcoR I和BamH I与Spe I产生的黏性末端不同，而限制酶Spe I和Xba Ⅰ产生的黏性末端相同，因此可将带有CaMV35S的CGRP基因和带有AMV的sCT基因连接，即可在引物1的5'端添加限制酶Xba I的识别序列5'-TCTAGA-3'。PCR反应体系中常需加入Mg2+，其目的是激活耐高温的DNA聚合酶，保证PCR高效进行。PCR每次循环包括变性、复性和延伸三步。 （3）因限制酶EcoR I和BamH I与Spe Ⅰ的识别序列不同，故带有CaMV35S的CGRP基因和带有AMV的sCT基因需反向连接构建成融合基因。该融合基因的两端分别含有限制酶EcoR I和BamH I的识别序列，同时质粒中含有这两种酶的切割位点，因此可用这两种酶切割质粒。普通质粒和重组质粒都带有四环素抗性基因，因此含有普通质粒和重组质粒的菌株都能在含四环素的培养基上生长，故无法区分。 （4）植物细胞培养通过调控营养、激素等条件，让转基因细胞快速增殖，同时高效表达sCT和CGRP，即扩大细胞数量并提高目的基因的表达水平，最终实现规模化、高产化生产。 7．（开封二模）多环芳烃（PAHs）是一种持久性有机污染物。某研究小组从受污染土壤中驯化培养出降解PAHs的细菌（如图1所示），并进行降解效率测定。由于该菌繁殖能力弱，研究人员通过PCR扩增的方法得到其降解PAHs的关键基因C12O基因，再将C12O基因连接到载体转入大肠杆菌中，期望获得可降解PAHs的转基因大肠杆菌。回答下列问题： (1)用液体培养基A富集培养PAHs降解菌后，③取培养液梯度稀释的目的是_____________。 (2)甲培养基统计的结果往往比实际值偏_____________。挑选20个单菌落接种至新培养基B的20个小格中培养，目的是_____________。 (3)为获得最佳长度的目标片段，用图2中三组引物分别进行PCR扩增，每次循环的步骤一般可分为________________。 (4)为将扩增后的目标片段插入载体后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致（如图3所示），需在引物R1、R2和R3的5′端添加限制酶_____________的识别序列，在Rx的5′端添加限制酶_____________的识别序列。 (5)将构建的基因表达载体成功导入大肠杆菌后，研究人员发现只有含R3与RX扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃，原因可能是_____________。 【答案】(1)便于获得单菌落，便于后续的分离纯化和计数 (2) 小 筛选出能高效降解 PAHs 的菌株 (3)变性、复性、延伸 (4) EcoR Ⅰ Sal Ⅰ (5)引物R3与引物Rx扩增出的目标基因序列丢失了C12O基因正常表达的调控及启动子的关键序列，导致目标基因C12O无法正常表达 【知识点】其他微生物的分离与计数、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【详解】（1）③取培养液梯度稀释，可使菌液中菌体分散为单个细胞，便于获得单菌落，便于后续的分离纯化和计数。 （2）当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以培养基统计的结果往往比实际值偏小。挑选20个单菌落接种至新培养基B的20个小格中培养，目的是筛选出能高效降解PAHs的菌株。 （3）每次循环的步骤一般可分为：变性（高温解旋）、复性（退火，引物与模板结合）、延伸（Taq 酶催化合成子链） 三步。 （4）为将扩增后的目标基因C12O插入载体pET-28a后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致，扩增后的产物中Rx端与卡拉霉素抗性基因的启动子一端连接，要做到定向插入，则需要在引物5′端添加限制酶的识别序列；据图可知，扩增后的目的基因产物中可能含有Mun Ⅰ和Xho Ⅰ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ和Xho Ⅰ所识别，所以对载体使用限制酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ切割，在R1、R2和R35′端添加限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，Rx5′端添加限制酶Sal Ⅰ的识别序列。 （5）R3结合在C12O基因上游的调控序列内部，所以引物R3与引物Rx扩增出的目标基因序列丢失了C12O基因正常表达的调控及启动子的关键序列，导致目标基因C12O无法正常表达。 8．（九师预测）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与Ti质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中，以获得转基因菊花。回答下列问题： (1)图2所示Ti质粒作为基因工程的载体，未标注出的结构元件是______，其作用是______。 (2)若仅利用EcoRI切割基因C和图2中Ti质粒，并进行重组，可能会出现______，可行的解决方案是：______。 (3)将含基因C的重组质粒导入农杆菌前常需要用______处理农杆菌，以方便重组质粒进入农杆菌。用含重组质粒的农杆菌侵染菊花愈伤组织后，通过______，可筛选出含有重组质粒的菊花细胞，后经过______技术即可获得转基因菊花。 (4)研究发现，大部分转基因菊花成功表达了基因C，花色发生了改变，少数转基因菊花在当代或子代中出现了花色性状不稳定甚至丢失的现象，可能的原因是______（答两点）。 【答案】(1) 复制原点 启动自我复制，确保遗传的稳定性或作为复制起点，确保目的基因的存在与遗传等 (2) 目的基因与质粒反向连接或自身环化 通过PCR技术替换基因C-端的EcoRⅠ酶识别序列，添加BamHⅠ酶识别序列，并用BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶切割目的基因和质粒 (3) Ca2+（或CaCl2） 将愈伤组织转移到添加潮霉素的特定培养基上培养 植物组织培养 (4)基因C整合到染色体的位置不恰当；基因C在细胞分裂过程中发生了丢失或突变；受体细胞对导入的外源基因存在甲基化等修饰导致其失活等 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）基因工程中，作为载体的质粒需具备以下基本结构：复制原点、启动子、标记基因、终止子、多个限制酶切割位点，图中未标注的结构是复制原点，其作用是启动自我复制，确保遗传的稳定性或作为复制起点，确保目的基因的存在与遗传等。 （2）若仅用同一种限制酶（如EcoRⅠ）切割目的基因（基因C）和质粒，二者两端会产生相同的黏性末端。此时可能出现：目的基因自身环化（两端黏性末端互补连接）、目的基因与质粒反向连接（目的基因两端黏性末端可正向或反向插入质粒）、质粒自身环化（未插入目的基因的质粒重新连接）。为避免上述问题，需使目的基因和质粒酶切后产生不同的末端，常用“双酶切法”。可通过PCR技术替换基因C-端的EcoRI酶识别序列，添加另一种限制酶（如图2质粒中含有的BamHⅠ）的识别序列，用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制酶同时切割目的基因和质粒，使二者两端形成不同末端，从而实现定向连接，避免自身环化和反向连接。 （3）将含基因C的重组质粒导入农杆菌之前，要先通过Ca2+处理农杆菌，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，易于吸收外源DNA（重组质粒）。质粒上的“潮霉素抗性基因”为标记基因，可通过抗性筛选实现受体细胞的筛选。具体操作为：用含基因C的农杆菌侵染菊花愈伤组织（植物细胞培养常用愈伤组织作为受体），再将愈伤组织转移到添加潮霉素的培养基上培养，只有含重组质粒（携带潮霉素抗性基因）的细胞才能存活，进而通过植物组织培养技术获得转基因植株。 （4）少数转基因菊花在当代或子代中出现了花色性状不稳定甚至丢失的现象，可能的原因有，整合位置不当；若基因C整合到染色体的异染色质区域（转录活性低）或重复序列区域，可能导致表达受抑制；基因丢失或突变；细胞分裂过程中，基因C所在的染色体片段可能丢失，或基因C发生碱基突变导致功能失活；表观修饰；受体细胞可能对导入的外源基因进行甲基化等表观修饰，导致基因沉默（无法转录）。 9．（华大联盟预测）为研究Lcat基因在肝脏代谢疾病中的作用，科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠11号染色体的H11位点（安全位点）插入Lcat基因，再通过代际杂交获得肝脏特异性表达Lcat的小鼠，流程如图1。图1中Cre小鼠的肝细胞可特异性表达Cre蛋白，Cre基因能调控目的基因在肝脏中的特异性表达。 回答下列问题： (1)据图1分析，CRISPR/Cas9基因编辑技术中，通过碱基互补配对识别靶DNA位点，Cas9蛋白可切割靶DNA将双链断裂，具有的功能类似于________酶的作用。 (2)图1中启动子的功能是________。在构建重组质粒的过程中，若要将图1中的Lcat基因插入质粒，切割质粒应选择的酶为________（填标号）。 ①Sau3A I：5'-↓GATC-3'；②Hind Ⅲ：5'-A↓AGCTT-3'；③Bcl I：5'-T↓GATCA-3'；④Xba I：5'-T↓CTAGA-3' (3)采用PCR技术检测Lcat基因在H11位点的插入情况，PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现Lcat基因的指数形式扩增。为确保扩增的特异性，引物的碱基序列应与Lcat基因的________端碱基序列互补。 (4)对图1中的实验小鼠和野生型（WT）小鼠的相关DNA进行凝胶电泳，结果如图2所示。根据电泳图谱分析，属于F2小鼠的是________（填“1”、“2”、“3”或“4”）。若验证Lcat基因在肝脏中特异性表达，可以从F2小鼠的肝脏和其他组织（如肌肉）中提取________，进行分子杂交检测。 (5)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在H11位点插入Lcat基因的优势是________（答一点）。 【答案】(1)限制（限制性内切核酸） (2) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动Lcat基因（目的基因）的转录 ③④ (3)3′ (4) 3 mRNA (5)实现Lcat基因在特定细胞中特异性表达（或避免随机插入导致的基因沉默、突变） 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）CRISPR/Cas9基因编辑技术中，gRNA通过碱基互补配对识别靶DNA位点，Cas9蛋白可切割靶DNA将双链断裂，具有的功能类似于限制性内切核酸酶。 （2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动Lcat基因（目的基因）的转录。由于Sau3AI会破坏质粒的复制原点，结合质粒上的限制酶和Lcat基因两端的序列可知，应选择③BclⅠ和④XbaⅠ进行切割，才能使质粒和目的基因产生相同的黏性末端，故选③④。 （3）PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现Lcat基因的指数形式扩增。DNA复制时，子链的延伸方向是5′端到3′端，为确保扩增的特异性，引物的碱基序列应与Lcat基因的3′端碱基序列互补。 （4）由图1可知，F0与野生型小鼠杂交后F1中含有Lcat基因和wt基因，编号1~4中，属于F1小鼠的是编号1；F1小鼠与Cre小鼠杂交后，F2小鼠同时含有wt基因、Lcat基因和Cre基因，对应编号3。检测基因的表达（转录）情况，需提取mRNA，通过分子杂交（DNA-RNA杂交）验证Lcat基因仅在肝脏组织转录出mRNA。 （5）CRISPR/Cas9基因编辑技术能将Lcat基因定点插入H11位点，相比随机插入，可避免插入到原癌基因等区域引发突变，同时保证基因稳定表达，实现Lcat基因在特定细胞中特异性表达。 10．（鹤壁一模）人血清白蛋白（HSA）是人血浆中主要的蛋白质，HSA的主要生理功能是维持血液胶体渗透压，临床上可用于烧伤或严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中的治疗。科学家利用PCR扩增HSA基因并构建了血清白蛋白植物表达载体（如下图），以紫花苜蓿子叶愈伤组织为受体细胞，通过农杆菌转化法进行遗传转化，获得了稳定表达HSA的转基因紫花苜蓿。回答下列问题： (1)扩增时应选用的引物是_______，并在引物的_______端加上Kpn I 或Sal I的识别序列。PCR循环一次需要经历变性、_______、_______等步骤。 (2)将扩增所得的HSA基因和质粒分别进行酶切，再利用_______酶将二者连接起来，将得到的重组质粒与农杆菌混合，并进行转化。提取农杆菌基因组，用（1）中的引物进行PCR，并用Kpn I和Sal I进行酶切，酶切产物电泳结果如下图，其中1号和4号分别是质粒（Kpn I和Sal I酶切位点间的距离忽略不计）和目的基因对照组，2号和3号中含有重组质粒酶切产物的是______。 (3)将转化后的农杆菌导入紫花苜蓿子叶愈伤组织细胞中，若HSA基因整合到了紫花苜蓿的染色体DNA上，则该愈伤组织细胞对_______有抗性；该转基因紫花苜蓿子叶愈伤组织细胞对另一种抗生素没有抗性的原因是_______。 【答案】(1) 引物Ⅱ、引物Ⅲ 5' 复性 延伸 (2) DNA连接 2号 (3) 潮霉素 卡那霉素抗性基因不在重组质粒的T-DNA范围内，不能随T-DNA一起整合到受体细胞染色体DNA上 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物与目的基因结合，所以需要根据目的基因设计引物，引物与模板的3'（DNA链含游离的-OH的一端）结合，故需要的引物是引物Ⅱ、引物Ⅲ；为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。因此需分别在引物Ⅱ、引物Ⅲ的5’端分别添加Kpn I 或Sal I限制酶的识别序列。PCR循环一次需要经历变性、复性和延伸等步骤。 （2）将PCR扩增的目的基因与质粒载体用相同的限制酶切割后，形成相同的末端，再用DNA连接酶处理，构建重组质粒。由于1号是质粒（Kpn I和Sal I酶切位点间的距离忽略不计）的电泳结果，可知质粒的大小为10000bp，4号是目的基因的电泳结果，可知目的基因的大小为2000bp，因此重组质粒的总大小应为12000bp，2号的酶切产物电泳结果大小总和符合12000bp，因此2号中含有重组质粒酶切产物。 （3）据图可知，卡那霉素抗性基因在T-DNA外，潮霉素抗性基因在T-DNA上，所以重组质粒上会带有潮霉素抗性基因，若HSA基因整合到了紫花苜蓿的染色体DNA上，该愈伤组织细胞对潮霉素有抗性；而卡那霉素抗性基因不在重组质粒的T-DNA范围内，不能随T-DNA一起整合到受体细胞染色体DNA上。 11．(安阳预测)为培育“一次播种、多季收获”的多年生水稻，我国科学家将长寿基因EBTl与匍匐生长基因 PROG1、TIG1融合，成功培育出可在海南存活至少两年的“类野生稻”植株。该研究部分过程如下图所示，其中数字1~6表示引物种类，a~f表示基因的脱氧核苷酸链，其中a、c、e为转录的模板链，箭头表示引物的方向，回答下列问题： (1)为了先将基因 PROG1、TIG1成功连接，研究人员需在引物_____的5′ 端添加两基因非模板链上的部分互补碱基序列“搭桥”将两个基因连接，从而获得融合基因。为提高PCR扩增的特异性，可采取的措施有_____ （答出2点）。 (2)构建基因表达载体过程中，需要用到的限制酶是_____。用含四环素的普通培养基_____（填“能”或“不能”）筛选出成功转化重组质粒的菌株。 (3)据图可知，将融合基因导入水稻细胞的方法是_____。将融合基因导入水稻细胞后，可通过_____技术检测融合基因是否成功转录；若要从个体水平验证融合基因表达成功，可进行的操作及预期结果是_____。 【答案】(1) 4和5 适当延长引物长度、避免引物自身或引物间互补、适当升高复性温度 (2) Xba I和 EcoR Ⅰ 不能 (3) 农杆菌转化法 PCR 将转基因水稻与野生型水稻种植在相同条件下，观察其生长特性；预期转基因水稻能表现出匍匐生长的性状，且可实现多年生、多次收割，而野生型水稻不具备该特性 【详解】（1）为了先将基因 PROG1、TIG1成功连接，需用引物4和5的5'端添加两基因非模板链上游的部分碱基互补配对序列“搭桥”连接 PROG1、TIG1/两个目的基因。为提高PCR扩增的特异性，可采取的措施有设计引物时适当延长引物长度、避免引物自身或引物间互补、适当升高复性温度等。 （2）BamH I会破坏TIG1基因，故应选用Xba I和 EcoR I构建基因表达载体。普通质粒和重组质粒都带有四环素抗性基因，因此含有普通质粒和重组质粒的菌株都能在四环素培养基上生长，故无法区分。 （3）据图可知，是利用Ti质粒的T-DNA将融合基因导入水稻细胞的，方法是农杆菌转化法。检测融合基因是否成功转录的方法是PCR等技术。若要从个体水平验证融合基因表达成功，可进行的操作是将转基因水稻与野生型水稻种植在相同条件下，观察其生长特性；预期结果是转基因水稻能表现出匍匐生长的性状，且可实现多年生、多次收割，而野生型水稻不具备该特性。 12．（郑外模拟）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 (1)已知目的基因①处的碱基序列为5＇-CCTTTCAGCTCA -3＇，为保证hCGβ基因正确插入质粒并表达，则设计①端对应的引物序列是5＇-_________-3＇（只写出从5＇端开始的前15个碱基），同时需在目的基因的②端添加_______限制酶的识别序列。为获取较多的目的基因，可进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、______、_______、引物、Mg2+、缓冲液等，扩增过程可分为_________三步。 (2)图示hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是____________。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是________。 (3)阶段Ⅱ在含有_________的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌，之后进一步进行重组DNA扩增。 (4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基________（填“需要”或“不需要”）添加组氨酸，可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取__________（填“上清液”或“沉淀物”），依据_________原理进行分子水平的检测。若能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 【答案】(1) CTCGAGCCTTTCAGC MumⅠ Taq DNA聚合酶/耐高温的DNA聚合酶 dNTP/4种脱氧核苷酸 变性、复性、延伸 (2) 有利于hCGβ进入内质网加工 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 (3)氨苄青霉素 (4) 不需要 上清液 抗原和抗体特异性结合 【详解】（1）在设计引物对hCGβ基因扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证正确连接，可在其两端添加不同的限制酶识别序列。由图可知，Sma Ⅰ会破坏目的基因，EcoR Ⅰ会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因（标记基因），后续要将重组质粒导入到组氨酸缺陷型酵母菌，而Sal Ⅰ会破坏质粒上的组氨酸合成酶基因，Xma Ⅰ识别序列与Sma Ⅰ识别序列相似，会破坏目的基因，因此，不能使用Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ和Xho Ⅰ，可在hCGβ基因两端应添加XhoⅠ、Mum Ⅰ限制酶识别序列。根据转录方向和质粒AOX1启动子位置确定，需在①处插入Xho Ⅰ的识别序列（5＇-CTCGAG-3＇），在②处插入Mum Ⅰ的识别序列，而①端对应的引物结合在①端模板链的3＇，与模板链的互补链方向一致，故①端对应的引物序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGC-3＇。PCR反应体系中除了需加入模板、引物、Mg2+、缓冲液等，还需要加入Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）和dNTP（4种脱氧核苷酸）。扩增过程一般可分为变性、复性、延伸三步。 （2）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，从而有利于hCGβ进入内质网中加工。AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因的表达。 （3）质粒的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，因此导入hCGβ基因表达载体的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，在含有氨苄青霉素的培养基上可以存活，从而被筛选出来。 （4）酵母菌是组氨酸缺陷型，重组质粒上含有组氨酸合成酶基因，成功导入重组质粒的酵母菌能自主合成组氨酸，可在不含组氨酸的培养基上生长，因此培养基不需要添加组氨酸。hCGβ蛋白是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，因此离心后目的蛋白存在于上清液中。分子水平检测目的蛋白，利用的是抗原—抗体杂交技术，其原理是抗原和抗体能够特异性结合。 13．（洛阳3月检测）利用基因工程技术生产人胰岛素的两种途径，其中途径1利用转基因牛作为乳腺生物反应器，途径2利用转基因大肠杆菌进行发酵生产。 回答下列问题： (1)获得基因工程所用的胰岛素基因，需先从人体胰岛B细胞的细胞质中获得mRNA，经________催化获得cDNA，利用PCR技术获得大量的胰岛素基因。构建重组质粒过程中，最好选用的限制酶是________。 (2)某同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物方向）。该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。无扩增产物的实验有________；实验⑥扩增出的DNA产物是________。 实验 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 无 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (3)途径1中为使目的基因能在乳腺细胞中表达，应将该基因与________的基因的启动子重组在一起；途径2筛选含目的基因大肠杆菌菌株的实验思路是________。 【答案】(1) 逆转录酶 EcoRⅠ和BamHⅠ (2) ①②④ 含目的基因和部分质粒序列的片段 (3) 乳腺中特异性表达 在含有四环素的培养基上利用稀释涂布平板法培养样品大肠杆菌，再将在含有四环素的培养基上生长的菌落（利用影印法影印）对应转移到含有青霉素的培养基上培养，比较分析两个培养基上的菌落生长情况（注解：在含有四环素的培养基上能正常生长而在含有青霉素的培养基上不能正常生长的菌落为含目的基因大肠杆菌菌株形成的菌落） 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【详解】（1）以mRNA为模板合成cDNA的逆转录过程需要逆转录酶催化；构建重组质粒时，选用EcoRⅠ和BamHⅠ两种不同限制酶，可产生不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自身环化、反向连接，同时保留完整的四环素抗性基因作为筛选标记，是最佳选择。 （2）PCR扩增需要模板和能特异性结合的引物：①模板为空白、④模板为空白，均无扩增模板，无法得到产物；②模板是不含目的基因的原质粒PO，引物1、2是针对目的基因设计的，无法在PO上特异性结合，因此也无扩增产物；③模板是重组质粒，引物配对正确，可以扩增；⑤模板PO的质粒骨架存在引物3、4的结合位点，可以扩增出不含目的基因的片段；⑥模板是重组质粒PX，引物3、4结合在目的基因的两侧，因此扩增出含目的基因和部分质粒序列的片段。 （3）乳腺生物反应器中，需要让目的基因仅在乳腺细胞中特异性表达，因此需要将目的基因与乳腺中特异性表达基因的启动子重组连接；本构建过程中，目的基因插入后破坏了青霉素抗性基因，四环素抗性基因保持完整，因此筛选思路是：在含有四环素的培养基上利用稀释涂布平板法培养样品大肠杆菌，再将在含有四环素的培养基上生长的菌落（利用影印法影印）对应转移到含有青霉素的培养基上培养，比较分析两个培养基上的菌落生长情况（注解：在含有四环素的培养基上能正常生长而在含有青霉素的培养基上不能正常生长的菌落为含目的基因大肠杆菌菌株形成的菌落）。 14．（郑州二测）烟粉虱是一个包含数十个隐存种（形态上难以区分，但存在不同程度的生殖隔离的独立物种）的物种复合群。研究人员常采用mtCOIPCR-RFLP（限制性片段长度多态性）技术进行烟粉虱隐存种的鉴定，其操作流程如下： 注：mtCOI基因指线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因，PCR扩增mtCOI基因片段时使用的是通用引物，能扩增出不同烟粉虱隐存种的mtCOI基因片段。 请回答下列问题： (1)提取烟粉虱DNA样品时，体积分数为95%的酒精以及2 mol/L的NaCl溶液的作用分别为______。 (2)某同学以mtCOI基因片段为模板，设计了如下两组通用引物，长度为18~22bp。请分析这2组引物的设计是否合理并说明理由：________。 (3)以4种烟粉虱隐存种为例，其mtCOI序列的酶切图谱如图甲所示。研究人员使用mtCOIPCR-RFLP技术对图甲中的4种烟粉虱隐存种进行了鉴定，电泳结果如图乙所示。结合图甲分析，图乙是利用______（填“TaqⅠ”或“VspⅠ”）酶鉴定的结果，说明其使用缺点为_______，造成该缺点的原因为_______。进一步地，可采用_______的方法进行检测，以获得准确的鉴定结果。 图甲注：黑色横条代表mtCOI基因片段。MED、MEAM1、AsiaII3、AsiaII9为不同隐存种的名称。TaqI和VspI为两种不同的限制酶，其识别位点以箭头表示。图乙注：该电泳使用的凝胶由1.2%的琼脂糖溶液制成，对条带大小较为接近的DNA片段区分度有限。 (4)实验室内，SlAnn5蛋白过表达的番茄在对烟粉虱的抗性上表现优异，在下一步的田间试验中，除关注SlAnn5蛋白过表达番茄的抗虫效果外，还应关注_______（从不同角度答出2点即可）等问题。 【答案】(1)沉淀DNA、溶解DNA (2)不合理。第一组引物，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部会发生互补配对，第二组引物，引物Ⅱ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对 (3) TaqI 很难将AsiaⅡ3和AsiaⅡ9区分开 AsiaⅡ3和AsiaⅡ9的mtCOI基因片段经（TaqI）酶切后的条带大小较为接近 测序 (4)对番茄产量、品质是否有负面影响；长期种植是否会迫使烟粉虱产生适应性，导致抗性失效；是否会对环境中其他有益昆虫造成不利影响等 【知识点】DNA的粗提取及鉴定、PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）DNA粗提取实验中，DNA不溶于酒精，可用体积分数95%的酒精作用是沉淀DNA；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较高，该浓度NaCl用于溶解DNA。 （2）PCR引物设计要求：引物不能自身互补，一对引物之间也不能互补，否则引物无法有效结合模板，无法扩增目的片段。两组引物设计都不合理。第一组引物，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部会发生互补配对，第二组引物，引物Ⅱ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对。 （3）结合图甲，TaqⅠ酶切后，AsiaⅡ3和AsiaⅡ9的mtCOI基因片段经（TaqI）酶切后的条带大小较为接近，这样很难将AsiaⅡ3和AsiaⅡ9区分开。要获得准确结果，可直接对产物进行DNA测序，得到序列信息准确鉴定。 （4）转基因作物田间试验，除目标性状（抗虫性）外，还需要关注对番茄产量、品质是否有负面影响；长期种植是否会迫使烟粉虱产生适应性，导致抗性失效；是否会对环境中其他有益昆虫造成不利影响等。 15．（信阳二模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员利用重叠延伸PCR（重叠链相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的DNA片段拼接起来）将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。利用重叠延伸PCR获取融合基因的基本过程如图1所示，所用的Ti质粒如图2所示，请回答下列问题： 注：Nco Ⅰ、BamH Ⅰ、Sac Ⅰ、Sal Ⅰ为限制酶酶切位点。启动子1、2属于真核细胞表达系统，Sm+是链霉素抗性基因，Amp+是氨苄青霉素抗性基因，GUS基因编码的酶能将无色物质X-Gluc分解，使植物细胞呈蓝色。 (1)PCR反应体系中需加入______（答两点）、4种脱氧核苷酸、引物、Mg2+、缓冲液等。PCR反应中的每次循环一般分为变性、______、延伸三步。 (2)图1中的PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，原因是______。为了重叠链顺利延伸，杂交的两条链分别为______（从字母“a”“b”“c”“d”中选）。获得融合基因后，用引物1和4继续进行PCR大量扩增该序列。 (3)根据图2中Ti质粒的结构及后续筛选的需要分析，在设计引物1和4时需分别加入限制酶______的识别序列。经过相应酶切处理后，将融合基因与该质粒在DNA连接酶作用下形成重组质粒。为了提高重组质粒导入农杆菌的效率，一般要用______处理农杆菌。 (4)用农杆菌侵染拟南芥后，为了将被侵染的拟南芥细胞进行脱菌处理以及筛选含有融合基因的拟南芥细胞，培养基上需要添加______。然后，通过______技术可培育出完整的转基因拟南芥植株。 (5)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的分布和含量。 【答案】(1) 模板、耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶） 复性 (2) 引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系时，它们会发生结合而失去作用 a、d (3) Nco Ⅰ、BamH Ⅰ Ca2+ (4) 链霉素、X-Gluc 植物组织培养 (5)绿色荧光点的分布与含量 【知识点】PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）PCR反应需要的成分包括：模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、热稳定Taq酶、Mg²⁺、缓冲液等，题目要求答两点，填模板DNA和Taq酶即可；PCR的循环步骤为变性→复性（退火）→延伸。 （2）PCR1的引物2和PCR2的引物3设计了互补的重叠序列，若放在同一PCR体系中，引物2和3会相互结合，无法正常扩增出PABD基因和GFP基因；a链和d链都是5′→3′正向链，3′端有互补重叠序列，能配对搭桥并被酶延伸；其他链方向或末端不匹配，无法重叠延伸。 （3）融合基因需插入启动子2与终止子之间的T-DNA 区，且要破坏GUS基因便于筛选，因此只能选用Nco Ⅰ 和BamH Ⅰ，因此引物两端需要分别添加这两种酶的识别序列；将重组质粒导入农杆菌时，需要用氯化钙（Ca²⁺）处理农杆菌，使其成为感受态细胞，提高转化效率。 （4）农杆菌侵染后，脱菌需要添加抗生素（链霉素）杀死农杆菌；融合基因插入替换了GUS基因，含融合基因的细胞不能表达GUS，结合题目信息，添加X-Gluc可筛选出含目的基因的细胞；植物细胞具有全能性，通过植物组织培养技术可将转基因细胞培育为完整植株。 （5）PA结合蛋白与GFP融合表达，PA分布在哪里，探针就结合在哪里，PA含量越高，绿色荧光强度越强，因此通过观察绿色荧光的分布和强度，即可了解PA的分布和含量。 16．（濮阳二模）人原癌基因erbB2编码的p185蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，该过程中人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。科研人员利用动物细胞融合技术制备相应的鼠源单克隆抗体（如图1），以期治疗肿瘤。回答下列问题： (1)为获得特异性识别p185蛋白的单克隆抗体，需要先向小鼠体内注射______（填“人肿瘤细胞”或“p185蛋白”）；为制备鼠源单克隆抗体，正确的操作顺序是______。 ①促融②选择培养基筛选③克隆化培养④分离脾脏中的B细胞和培养骨髓瘤细胞 (2)鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员构建人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如图2（已知人和鼠抗体的可变区基因和恒定区基因均可获得）。图中引物1、引物2折线部分表示不与融合基因序列互补配对；a链为转录时的编码链。 ①根据以上信息和图1推测，融合基因应包含______。 A．人抗体可变区基因  B．鼠抗体可变区基因 C．人抗体恒定区基因  D．鼠抗体恒定区基因 ②为保证连接准确性和效率，图2步骤a应选用的限制酶为_______；引物1折线部分为_______的识别序列。（选填编号） I．MboI  Ⅱ．XbaI  Ⅲ．ScaI ③图2步骤b常用的方法为______。加入四环素后，选用发_______（填“红色”或“蓝色”）荧光的受精卵用于后续操作。 (3)检测发现，转基因小鼠乳汁中嵌合抗体含量较低，推测可能原因是______。（答出2点） 【答案】(1) p185蛋白 ④①②③ (2) BC Ⅱ、Ⅲ Ⅱ 显微注射法 红色 (3)①山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠乳腺细胞中作用效果不理想，抗体表达量低；②融合基因表达正常，但小鼠乳腺细胞无高效的针对其运输及分泌机制；③融合基因被某些化学基团修饰，阻碍转录的发生；④融合基因正常转录，但融合基因的 mRNA 因 RNA 干扰而被切割 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【详解】（1）要获得特异性识别p185蛋白的单克隆抗体，需向小鼠体内注射p185蛋白作为抗原，刺激小鼠的免疫系统产生相应的B淋巴细胞，而人肿瘤细胞包含众多抗原成分，无法保证产生针对p185蛋白的特异性抗体，所以应注射p185蛋白。制备鼠源单克隆抗体，因为脾脏是B细胞的重要来源，骨髓瘤细胞能无限增殖，所以首先要分离脾脏中的B细胞和培养骨髓瘤细胞；接着进行促融，使B细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞；然后用选择培养基筛选出杂交瘤细胞（未融合的B细胞不能无限增殖，未融合的骨髓瘤细胞不产生抗体，只有杂交瘤细胞既能无限增殖又能产生抗体）；最后进行克隆化培养，以获得大量能产生特定抗体的杂交瘤细胞，所以操作顺序是④①②③。 （2）①与抗原结合的位点位于抗体可变区，且鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，因此研制人鼠嵌合抗体可将图1中的鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区组合，则融合基因应包含鼠抗体可变区基因和人抗体恒定区基因，BC正确，AD错误。 ②目的基因和运载体必须用同种限制酶进行切割，且目的基因只能用限制酶ScaⅠ和XbaⅠ进行切割（限制酶MboⅠ会破坏目的基因），所以图2步骤a应选用的限制酶为Ⅱ、Ⅲ。因为转录时a链为编码链，b链为模板链，转录方向向右，同时结合载体上P1箭头方向（转录方向），所以引物1折线部分为XbaⅠ的识别序列，即选Ⅱ。 ③图2步骤b是将重组DNA分子导入受体细胞，对于动物细胞（小鼠受精卵），常用的方法是显微注射法。从图2可知，重组DNA分子中含有四环素诱导启动子（P2）和红色荧光蛋白基因，加入四环素后，只有导入了重组DNA分子的受精卵（即目标细胞）才能在P2启动下表达红色荧光蛋白，发出红色荧光，所以选用发红色荧光的受精卵用于后续操作。 （3）若检测小鼠乳汁中的人鼠嵌合抗体水平，发现其含量较低，原因可能有山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠乳腺细胞中作用效果不理想，无法有效启动嵌合抗体基因的转录，抗体表达量低；融合基因表达正常，但小鼠乳腺细胞无高效的针对其运输及分泌机制，使得合成的抗体不能有效地运输到细胞外并分泌到乳汁中；融合基因被某些化学基团修饰，阻碍转录的发生；融合基因正常转录，但融合基因的mRNA因RNA干扰而被切割，导致其稳定性降低等。 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 2027届高考高三复习模考题专项训练-河南版-选择性必修三 第一章：发酵工程 1．（濮阳二模）Ca2+是细胞生命活动的关键离子，在动植物生理及生物技术中参与多种过程。下列叙述错误的是（　　） A．可用高Ca2+-高pH融合法促进植物原生质体融合，进而获得杂交细胞 B．PCR实验中，Ca2+可激活耐高温的DNA聚合酶，保障DNA扩增的高效进行 C．哺乳动物血液中Ca2+浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐等症状 D．用Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 2．（濮阳二模）科研人员从健康水稻根际土壤中，筛选能抑制稻瘟病菌生长的芽孢杆菌，流程如下图。为验证抑菌物质的性质，对筛选到的目标菌株进行了进一步实验。下列叙述正确的是（　　） 土壤取样→梯度稀释→涂布分离→纯化培养→计数→抑菌实验→性质验证 A．稀释涂布平板法的计数结果通常高于实际活菌数量 B．该实验流程中，平板划线法可替代稀释涂布平板法进行计数 C．筛选芽孢杆菌的培养基，接种后必须先倒平板再高压蒸汽灭菌 D．为验证抑菌物质是否为蛋白质，先用蛋白酶处理目标菌株的培养液，再做抑菌实验 3．（信阳二模）青霉素能破坏细菌的细胞壁从而杀死细菌。工业上常用产黄青霉菌生产青霉素，发酵过程需要大量氧气。血红蛋白携带氧气能力强，将其引入青霉菌可能提高青霉素产量。下列说法正确的是（　　） A．配制培养基时，除必要营养成分外，还需将pH调至弱碱性 B．接种前的菌种需经扩大培养，目的是增加发酵罐中青霉菌起始数量 C．青霉菌自身产生的青霉素具有杀菌作用，因此培养液无需严格灭菌 D．可将哺乳动物成熟红细胞与青霉菌进行细胞融合，以保障青霉素持续高产 4．（郑州二测）东北辣白菜是传统发酵食品，制作时常加入苹果、梨、大蒜、生姜等辅料，入坛中密封发酵。下列叙述正确的是（　　） A．装坛前，需对苹果、梨、大蒜、生姜等辅料进行消毒灭菌 B．发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸和少量CO2使pH降低 C．若发酵坛密封不严，会导致乳酸菌繁殖过快致使辣白菜酸度过高 D．发酵后期，乳酸含量积累到一定程度会反过来抑制乳酸菌的活性 5．(安阳预测)豆糁是河南省豫东地区的传统即食发酵食品，以黄豆为主料，经蒸煮、发酵、调味、成型、晾晒等传统工艺制成，根据配料不同，有五香、微辣、麻辣等多种口味。下列叙述错误的是（    ） A．参与制作豆糁的发酵菌种属于混合菌种 B．制作时发酵材料和发酵装置应严格灭菌 C．蒸煮和添加的配料都具有防腐杀菌作用 D．豆糁中含有多种容易消化吸收的有机物 6．（鹤壁一模）腐乳、泡菜、果酒、果醋等发酵食品深受消费者青睐，这些美食的制作都离不开传统发酵技术。下列有关叙述错误的是（　　） A．传统发酵缺乏对菌种的选育，以混合菌种的固体或半固体发酵为主 B．毛霉将豆腐中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，使腐乳味道鲜美 C．制作出的泡菜“咸而不酸”可能是因为食盐浓度过高或发酵温度过低 D．葡萄酒制作完成后，只需要打开瓶盖通入空气即可进行葡萄醋的发酵 7．（华大联盟预测）ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种优良的天然食品防腐剂。ε-PL能抑制多种微生物的活性，且在人体内可被分解为赖氨酸。从土壤中分离出能分泌ε-PL的微生物的流程如图所示。ε-PL可使亚甲基蓝褪色，形成透明圈。下列叙述正确的是（    ） A．土样、培养基和接种工具等均需要严格灭菌处理，以防止杂菌污染 B．步骤Ⅰ、Ⅲ的接种方法分别是涂布平板法、平板划线法 C．步骤Ⅲ中应挑选菌落③接种到固体培养基表面培养，进一步筛选出目的菌株 D．若要从丁培养基中收集ε-PL，则采用过滤、沉淀等方法将菌体分离提纯干燥 8．（九师预测）在工业化生产青霉素的过程中，发酵工程发挥了关键作用。已知工业上生产青霉素的主要菌种是产黄青霉。下列叙述正确的是（　　） A．青霉素是产黄青霉的次级代谢产物，从发酵液中提取的青霉素不可直接用于治疗 B．发酵罐中的培养基需要通过灼烧的方式灭菌，该方法可杀死所有微生物及其孢子 C．产黄青霉发酵时需要持续通入无菌氧气以满足其代谢需求 D．通过诱变育种选育高产菌株是提高青霉素产量的唯一措施 9．（开封二模）乳糖需经乳糖酶分解才能被人体吸收利用。缺少乳糖酶的人摄入乳糖后，易出现腹泻。科研人员筛选生产乳糖酶优良菌种的过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） 注：X-gal为乳糖酶的显色底物，乳糖酶可与无色的X-gal反应产生蓝色物质。 A．对微生物进行纯培养的步骤一般为配制培养基、接种、灭菌、分离和培养 B．菌落直径与蓝色圈直径之比越小，菌落中微生物产生乳糖酶的能力越强 C．图中②接种方法只适合用于筛选微生物，不适合对微生物进行计数 D．乳糖酶属于优良菌种生产的单细胞蛋白，可以有效去除牛奶中的乳糖 10．（开封一模）苹果表皮上附着有野生的醋酸菌。可从苹果上筛选优质醋酸菌种，用于苹果醋的制作，筛选过程如图。下列叙述错误的是（    ） A．初筛时，扩大培养需用液体培养基进行振荡培养 B．筛选用的培养基应采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌 C．筛选时产生了透明圈的为“符合要求”的单菌落 D．缺少糖源和氧气时，醋酸菌可将乙醇转化为醋酸 11．（洛阳检测）青霉素发酵是高耗氧过程，在发酵过程中总有头孢霉素产生，二者是由共同的前体分别经过酶A 和酶B作用后合成，如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．欲获得青霉素，培养基、发酵设备及发酵过程都要严格灭菌 B．发酵结束后，可通过提取、分离和纯化获得所需要的产品 C．为了提高青霉素的产量，可敲除青霉菌株中控制酶B 的基因 D．为了保证发酵过程中高效供氧，可尝试将人血红蛋白基因导入青霉菌 12．（新乡三模）人参皂苷是人参中重要的活性成分。研究者利用某种乳酸菌（LGG）转化人参皂苷，工艺包括：菌种的选育、扩大培养、培养基的配制和灭菌、接种、发酵、分离和提纯人参皂苷。下列叙述错误的是（    ） A．利用基因工程处理可获得人参皂苷转化能力更强的乳酸菌种 B．人参原材料、接种工具、培养基和发酵设备等必须使用无菌技术 C．用稀释涂布平板法和血细胞计数板计数法直接统计乳酸菌活菌数 D．LGG接种量过多会因菌体竞争、代谢副产物累积抑制皂苷合成 13．（许洛平济质量检测）乙醇梭菌可利用钢铁厂尾气中的CO、CO2为无机碳源，H2为还原剂，发酵生产乙醇与单细胞蛋白，流程如图所示；该菌种安全无毒，可用于食品及饲料工业。现代发酵工程正借此朝着智能化、绿色化、高值化转型升级。下列叙述错误的是（　　） A．发酵过程中产生的乙醇和单细胞蛋白都属于乙醇梭菌的次生代谢物 B．利用钢铁厂尾气进行发酵生产，可帮助实现碳中和并减小生态足迹 C．乙醇梭菌是自养厌氧型细菌，发酵过程中适度搅拌可提高发酵速率 D．发酵最终得到的单细胞蛋白可以用作饲料，使家畜、家禽增重加快 14．（豫南名校联考）为初步筛选高产异亮氨酸菌株，研究人员将待测菌接种在琼脂块上，再将琼脂块转接到含有异亮氨酸缺陷型指示菌的平板上，培养后观察琼脂块周围指示菌的生长圈，结果如下图。相关叙述正确的是（　　） A．该筛选原理与抑菌圈法相同，待测菌抑制指示菌的生长 B．培养基以异亮氨酸为唯一氮源，采用湿热灭菌法灭菌 C．接种指示菌时应在酒精灯火焰旁采用平板划线法接种 D．指示菌生长圈越大，待测菌产异亮氨酸的能力越强 15．（豫南名校联考）精酿啤酒由于更丰富的口感受到消费者的青睐。下图是某精酿啤酒的发酵流程图，相关叙述错误的是（　　） A．可使用赤霉素对大麦进行处理，麦芽粉碎可方便后续的糖化过程 B．加入啤酒花可产生丰富的口感，蒸煮可终止酶的进一步作用 C．回旋沉淀、冷却后加入酵母菌，在发酵罐内进行主发酵 D．发酵后不过滤、不消毒、保留活酵母的精酿啤酒，保质期时间较长 第二章：细胞工程 1．（濮阳二模）Ca2+是细胞生命活动的关键离子，在动植物生理及生物技术中参与多种过程。下列叙述错误的是（　　） A．可用高Ca2+-高pH融合法促进植物原生质体融合，进而获得杂交细胞 B．PCR实验中，Ca2+可激活耐高温的DNA聚合酶，保障DNA扩增的高效进行 C．哺乳动物血液中Ca2+浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐等症状 D．用Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 2．（濮阳二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶驱动两侧基因转录，研究人员利用Ti质粒构建如图所示基因表达载体，用于检测双向启动子功能。下列叙述错误的是（　　） A．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 B．可通过荧光+蓝色显色双重检测，更准确判断双向启动子是否双向起效 C．双向启动子驱动GUS与LUC转录时，不能使用同一条DNA单链作为模板链 D．为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 3．（郑州二测）某研究团队开发了一种工程化囊泡靶向修复心脏损伤的新技术，流程如图所示，其中血小板的膜具有较好的靶向能力。下列叙述错误的是（　　） A．成纤维细胞能形成iPS细胞，证明其具有全能性 B．血小板膜与囊泡膜的融合体现了生物膜的流动性 C．工程化囊泡的定向输送与受损部位细胞膜或血小板膜上的特定受体有关 D．利用该技术修复受损心脏可以规避免疫排斥，无需使用免疫抑制剂 4．（洛阳3月检测）铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一。以铁皮石斛新生营养芽为材料，培养拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验如图所示。下列说法不正确的是（    ） A．铁皮石斛产生的生物碱属于其次生代谢产物 B．过程①诱导新生营养芽变成PLBs的关键是适宜的植物激素和营养条件 C．过程②培养高产细胞系应选择细胞数量/生物碱产量比值大的PLBs D．PLBs重量、光照等因素均会影响生物碱的产量 5．（洛阳3月检测）科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体—药物偶联物（ADC），以便精准治疗肿瘤，ADC的作用机制如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．单克隆抗体制备过程中需要的抗原来自人特定的肿瘤细胞 B．抗体进入特定的肿瘤细胞导致其裂解死亡 C．ADC能精准治疗特定肿瘤细胞的原理是抗体与抗原的特异性结合 D．药物可能进入肿瘤细胞核并调控基因的表达 6．（郑外模拟）研究者将早期胚胎不同位置的两种细胞a和b置于相同培养液中进行独立培养或混合培养，结果如下图。下列叙述错误的是（　　） A．培养液中通常应加入动物血清 B．细胞a和b来自滋养层细胞 C．独立培养后细胞a和b出现稳定性差异 D．细胞的“命运”可被环境信号改变 7．（郑外模拟）下列关于中学生物学实验的叙述，错误的是（　　） A．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验中，检测试剂可选用斐林试剂 B．尝试利用乙烯利催熟水果实验中，当溶液pH<3.5时，它会分解释放出乙烯 C．DNA的粗提取与鉴定实验中的提取过程可以不使用离心机 D．观察叶绿体和细胞质的流动实验过程均需保持细胞活性 8．(安阳预测)科学家将用干细胞培育的人类肠道、肝脏及大脑等“类器官”，直接注入怀孕母鼠的羊膜腔内（充满羊水），这些“类器官”成功“入住”发育中的小鼠胚胎，精准归巢至对应器官（肠、肝、脑），并在小鼠出生后长期稳定存活且发挥功能。下列叙述正确的是（    ） A．与直接注入胚胎相比，注入羊膜腔的伤害性较小 B．培育“类器官”的过程利用了细胞核移植技术 C．“类器官”的培育和移入胚胎都无免疫排斥反应 D．该技术是干细胞的利用，不会涉及伦理问题 9．（鹤壁一模）iPS细胞在人类疾病治疗方面有广阔的应用前景，用iPS细胞治疗镰状细胞贫血的过程如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．①过程往往需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理获得的组织 B．②过程需用Ca2+处理体细胞，以利于其吸收特定的DNA分子 C．③④过程需在含一定CO2的环境中进行，以维持培养液的pH D．用iPS细胞治疗镰状细胞贫血理论上不会发生免疫排斥反应 10．（九师预测）髓系细胞触发受体2（TREM2）是一种免疫抑制受体，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。TREM2抗体药物有望提高肿瘤免疫疗法的疗效。如图为TREM2单克隆抗体的制备流程图。下列叙述正确的是（　　） A．制备单克隆抗体过程中需对细胞进行至少三次筛选 B．经步骤②诱导融合后的细胞都能分泌TREM2抗体 C．诱导动物细胞融合不同于诱导植物细胞融合的方法是灭活病毒诱导 D．TREM2单克隆抗体具有准确识别抗原细微差异又可无限增殖的特点 11．（九师预测）在胚胎工程研究中，受精卵培养至囊胚后分三组处理：甲组直接移植：乙组体外暴露于生长因子液后移植：丙组在信号分子抑制剂中孵育后移植。结果甲组和乙组部分胚胎成功着床（胚胎和母体建立物质交换）并发育，丙组全部着床失败。下列叙述正确的是（　　） A．甲组结果说明胚胎着床不依赖于外界信号分子，完全自主 B．若乙组着床率高于甲组，可能因生长因子诱导基因突变增强适应性 C．丙组无法着床，表明信号通路正常激活是胚胎与子宫妊娠关系的前提 D．着床仅取决于受体子宫状态，三组差异均由受体个体差异导致 12．（开封三模）银缕梅是我国特有的珍稀濒危物种，被称为“被子植物的活化石”。为缓解银缕梅濒危现状，研究人员以银缕梅带芽茎段为外植体，利用植物组织培养技术成功建立了组培快繁体系，其大致流程如图所示（其中②为诱导生根）。下列叙述错误的（    ） A．该植物组培快繁的流程是①→③→②→④→⑤→⑥ B．②过程使用的培养基中生长素/细胞分裂素的值应大于1 C．④和⑤过程除提供必要营养物质、植物激素外，还需提供一定光照 D．⑥为移栽过程，移栽前需用流水清洗掉根部的培养基，提高成活率 13．（洛阳检测）传统中药材铁皮石斛富含某些糖类和生物碱，可以用来提取药物，近年来需求日益增加。利用植物组织培养技术获得试管苗已形成一定规模，有助于解决野生资源短缺问题。下列叙述正确的是（    ） A．进行再分化的培养基不含有机碳源 B．培养基先分装到锥形瓶，封口后用干热灭菌法灭菌 C．植物体细胞具有全能性，但生殖细胞不具有全能性 D．培养基中生长素含量大于细胞分裂素时，有利于诱导愈伤组织生根 14．（新乡三模）利用膀胱生物反应器生产人血清白蛋白，基本流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．操作②是对早期胚胎进行移植，移植前需对受体母猪进行超数排卵处理 B．膀胱生物反应器不受性别及发育限制，产量一定高于乳腺生物反应器 C．若操作①和操作②成功，则操作③就能从尿液中检测到人血清白蛋白 D．操作①使用膀胱中特异表达基因的启动子可避免对其他组织产生影响 15．（豫南名校联考）精酿啤酒由于更丰富的口感受到消费者的青睐。下图是某精酿啤酒的发酵流程图，相关叙述错误的是（　　） A．可使用赤霉素对大麦进行处理，麦芽粉碎可方便后续的糖化过程 B．加入啤酒花可产生丰富的口感，蒸煮可终止酶的进一步作用 C．回旋沉淀、冷却后加入酵母菌，在发酵罐内进行主发酵 D．发酵后不过滤、不消毒、保留活酵母的精酿啤酒，保质期时间较长 第三章：基因工程与蛋白质工程 1．（濮阳二模）Ca2+是细胞生命活动的关键离子，在动植物生理及生物技术中参与多种过程。下列叙述错误的是（　　） A．可用高Ca2+-高pH融合法促进植物原生质体融合，进而获得杂交细胞 B．PCR实验中，Ca2+可激活耐高温的DNA聚合酶，保障DNA扩增的高效进行 C．哺乳动物血液中Ca2+浓度过低会导致神经肌肉兴奋性升高，出现抽搐等症状 D．用Ca2+处理大肠杆菌，可使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 2．（濮阳二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶驱动两侧基因转录，研究人员利用Ti质粒构建如图所示基因表达载体，用于检测双向启动子功能。下列叙述错误的是（　　） A．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 B．可通过荧光+蓝色显色双重检测，更准确判断双向启动子是否双向起效 C．双向启动子驱动GUS与LUC转录时，不能使用同一条DNA单链作为模板链 D．为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 3．（郑州二测）下列有关生物学实验或探究实践的叙述，错误的是（　　） A．利用甲紫溶液对洋葱根尖分生区细胞的染色体染色后需用清水进行漂洗 B．“探究抗生素对细菌的选择作用”时，要从抑菌圈边缘的菌落上挑取细菌 C．常采用记名计算法和目测估计法统计土壤中小动物类群的物种相对数量 D．从土壤中分离分解尿素的细菌时，需以尿素作为唯一氮源的选择培养基 4．（郑外模拟）下列关于中学生物学实验的叙述，错误的是（　　） A．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验中，检测试剂可选用斐林试剂 B．尝试利用乙烯利催熟水果实验中，当溶液pH<3.5时，它会分解释放出乙烯 C．DNA的粗提取与鉴定实验中的提取过程可以不使用离心机 D．观察叶绿体和细胞质的流动实验过程均需保持细胞活性 5．（九师预测）在工业化生产青霉素的过程中，发酵工程发挥了关键作用。已知工业上生产青霉素的主要菌种是产黄青霉。下列叙述正确的是（　　） A．青霉素是产黄青霉的次级代谢产物，从发酵液中提取的青霉素不可直接用于治疗 B．发酵罐中的培养基需要通过灼烧的方式灭菌，该方法可杀死所有微生物及其孢子 C．产黄青霉发酵时需要持续通入无菌氧气以满足其代谢需求 D．通过诱变育种选育高产菌株是提高青霉素产量的唯一措施 6．（适应性演练）Noxa是一种促凋亡蛋白。为构建表达Noxa的工程菌，现利用PCR技术将Noxa基因连接在ClyA基因的下游，构建ClyA-Noxa融合基因，并插入P载体。两个基因及四条引物如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．为方便构建融合基因，R1和F2引物设计时需要引入一定长度的互补序列 B．为保证插入P载体的准确性，F1和R2引物设计时应引入不同的酶切位点 C．为高效准确构建含ClyA-Noxa融合基因的表达载体，需至少使用4种限制酶 D．为筛选成功转化后的工程菌，可以使用F1和R2的引物组合进行PCR鉴定 7．（新乡三模）利用膀胱生物反应器生产人血清白蛋白，基本流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．操作②是对早期胚胎进行移植，移植前需对受体母猪进行超数排卵处理 B．膀胱生物反应器不受性别及发育限制，产量一定高于乳腺生物反应器 C．若操作①和操作②成功，则操作③就能从尿液中检测到人血清白蛋白 D．操作①使用膀胱中特异表达基因的启动子可避免对其他组织产生影响 8．（豫南名校联考）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠P蛋白基因的一端，如图1所示。随机挑取5个品系细胞通过PCR验证GFP的导入情况，结果如图2所示。据此推测在进行PCR扩增时，所选择的引物为（　　） A．F1，R1 B．F2，R1 C．F1，R2 D．F2，R2 第四章：基因工程大题专练 1．（许洛平济质量检测）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为研究纤毛相关蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可显示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒，如图所示。 回答下列问题： (1)在选择合适的质粒构建载体时，该质粒需具备的基本条件有_______（答出2点即可）。 (2)为保证将融合片段M完整导入载体Y，需要选用EcoR V来切割载体和目的基因。连接载体和目的基因时，需要用_______（填“E.coli”或“T4”）DNA连接酶来保证高效连接。用PCR检测融合片段M是否正确连接时需选用的引物是_______。 (3)经鉴定M片段已正确连接，但因采用平末端连接方式，接头处易出现碱基缺失或插入。为确保M及连接处序列正确，需要对Y-M连接处进行测序，结果如图所示。显示出正确结果的应该是序列________填写序列编号），原因是_______。 (4)为检测蛋白质X在细胞中的定位，科学家使用对照质粒Y-GFP（仅表达GFP，可使整个细胞散发荧光）与实验质粒Y-M来进行实验。请写出实验设计思路_______。 2．（新乡三模）某患儿因CPS1基因中一个碱基G突变为碱基A，导致肝细胞无法合成有活性的CPS1酶，尿素循环受阻，血氨蓄积引发脑损伤。研究人员利用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）修复该突变，使患儿血氨水平恢复正常。如图所示，ABE核心组件包含两部分：①针对CPS1基因突变位点的向导RNA（gRNA）；②由腺苷脱氨酶（TadA）与Cas9缺口酶（nCas9）融合而成的ABE蛋白。回答下列问题。 (1)gRNA能够精准定位CPS1基因突变位点的分子基础是_________________。 (2)nCas9能精准识别并切割缺陷基因，其作用原理与基因工程中的________酶相似，该酶的作用特点是_______________。TadA将致病碱基A脱氨转化I，细胞修复系统将I替换为G，完成A→G的精准修复。 (3)若要检测治疗是否成功，可提取患儿肝脏细胞的总RNA，通过________技术检测CPS1基因是否转录；还可检测血液中氨及有害化合物含量，若含量__________，则说明编辑有效。 (4)研究者采用一定的措施将ABE mRNA和gRNA送入肝细胞，ABE mRNA在肝细胞内翻译出ABE蛋白启动碱基编辑，修复完成后，mRNA和gRNA会被自然降解。与通过病毒载体将正常CPS1基因直接导入患者体内的基因治疗相比，这种修复方法的优点是_______________（答出2点）。 3．（适应性演练）培育抗穗发芽小麦品种对保障国家粮食安全具有重要意义。节节麦是普通小麦基因组的供体种。研究者筛选到抗穗发芽节节麦T093，将其与小麦品种W018杂交，子代与W018多次回交，构建了渗入节节麦基因的小麦染色体片段渗入系，挖掘出与种子休眠相关的候选基因P。回答下列问题： (1)与W018相比，渗入系小麦的遗传多样性____（填“增加”或“减少”）。 (2)在筛选抗穗发芽育种材料的过程中，研究人员测定了W018和杂交后代H495的相关指标，结果如图1所示。H495的抗穗发芽能力____（填“高于”或“低于”）W018，可能的机制为____。 (3)Taq酶会在PCR产物的3＇端添加单个腺嘌呤脱氧核苷酸。利用PCR扩增基因P，扩增产物与pMD19-T载体（图2）构建重组质粒时，____（填“需要”或“不需要”）利用限制酶剪切目的基因。 (4)不同来源基因P的碱基差异如图3所示。密码子的简并性主要集中在第三位碱基。相较于W018，推测H495的DNA序列中最有可能引起氨基酸改变的位点是____bp。H495中基因P的碱基变化可能是由T093的基因渗入造成，与穗发芽抗性差异有关，判断的依据是____。 4．（洛阳检测）CART 蛋白参与摄食和体重调节、内分泌调节等相关生理功能，研究者把牛CART基因和萤火虫的荧光素酶基因(LUC基因)拼接成融合基因，融合基因中LUC基因在前， CART基因在后；图甲是融合基因放大图，图乙是大肠杆菌质粒，回答以下问题： (1)据图甲，利用PCR技术扩增融合基因，左侧和右侧引物序列应分别是____和____。 (2)根据图乙载体的结构，为了使扩增后的融合基因能和载体进行正确连接形成重组DNA分子，并能按正确方向转录，利用PCR技术扩增融合基因时还需要在融合基因左侧引物5’端添加限制酶____的识别序列，另一引物5’端添加限制酶____的识别序列。 (3)用融合蛋白基因两端的序列做引物进行PCR可检测融合蛋白基因是否插人大肠杆菌的质粒，该过程所用的模板是____，若导入了融合蛋白基因则实验结果是____。推测把 CART基因和LUC基因拼接成融合基因的目的是____。 5．（开封一模）甲醛是一种来源广泛的挥发性有机污染物，具有强烈的致癌和致畸作用，可利用微生物降解甲醛来治理甲醛污染，具有高效、环保、无二次污染等优点。下表为相关限制酶的识别序列及酶切位点，下图为培育转甲醛分解基因大肠杆菌的过程示意图。回答下列问题： 限制酶 识别序列及酶切位点 限制酶 识别序列及酶切位点 MboI 5'…↓GATC…3' SacI 5′…GAGCT↓C…3' SnaBI 5′…TAC↓GTA…3' BamHI 5'…G↓GATCC…3' (1)培养大肠杆菌的培养基需加入____让培养基呈固体状态；培养基需为目标细菌提供的营养包括水、无机盐、______。 (2)可利用PCR技术扩增甲醛分解基因，PCR技术中引物的作用是_______，故应选择图中引物_____来扩增甲醛分解基因。 (3)为保证甲醛分解基因与载体的正向连接，在设计PCR引物时，应在所选引物的_____（填“3'”或“5'’”）端添加相应限制酶的识别序列，左端和右端引物相应位置需要依次添加限制酶________的识别序列。 (4)利用图中所给的信息设计实验筛选未导入质粒、导入空质粒（不含目的基因）和导入重组质粒（含目的基因）的受体菌，写出实验设计思路并预期实验结果_______。 6．（开封三模）降钙素是甲状腺滤泡旁细胞分泌的一种激素，可与破骨细胞表面受体结合，抑制破骨细胞增殖，有效治疗骨质疏松症。为降低生产成本，研究人员利用基因工程技术将鲑鱼降钙素（sCT）基因与降钙素基因相关肽（CGRP）基因连接成融合基因，在DNA连接酶的作用下连接到质粒上，构建出重组质粒，经农杆菌介导法转化到生菜中，进而利用植物细胞培养工厂化生产sCT和CGRP。sCT基因、CGRP基因和质粒的结构、限制酶的识别序列及切割位点如图所示。 (1)图中的CaMV35S和AMV均能在生菜不同细胞中高效、持续表达且驱动相关基因的____________过程。CaMV35S和AMV二者属于_____（填“诱导型”或“组成型”）启动子。 (2)第一步，利用PCR技术将sCT基因与CGRP基因连接成融合基因，但需要给引物1添加的限制酶识别序列是5′-___________-3′。PCR反应体系中常需加入一定量的Mg2+，目的是____________。扩增过程中，每次循环包括_______三步。 (3)第二步，将构建的融合基因导入质粒的T-DNA片段，需要用到的限制酶是______（填种类）。用含四环素的普通培养基____（填“能”或“不能”）筛选出成功转化重组质粒的菌株，理由是____________。 (4)利用植物细胞培养技术工厂化生产sCT与CGRP主要是通过提供促进细胞生长的条件来____________，进而提高产量。 7．（开封二模）多环芳烃（PAHs）是一种持久性有机污染物。某研究小组从受污染土壤中驯化培养出降解PAHs的细菌（如图1所示），并进行降解效率测定。由于该菌繁殖能力弱，研究人员通过PCR扩增的方法得到其降解PAHs的关键基因C12O基因，再将C12O基因连接到载体转入大肠杆菌中，期望获得可降解PAHs的转基因大肠杆菌。回答下列问题： (1)用液体培养基A富集培养PAHs降解菌后，③取培养液梯度稀释的目的是_____________。 (2)甲培养基统计的结果往往比实际值偏_____________。挑选20个单菌落接种至新培养基B的20个小格中培养，目的是_____________。 (3)为获得最佳长度的目标片段，用图2中三组引物分别进行PCR扩增，每次循环的步骤一般可分为________________。 (4)为将扩增后的目标片段插入载体后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致（如图3所示），需在引物R1、R2和R3的5′端添加限制酶_____________的识别序列，在Rx的5′端添加限制酶_____________的识别序列。 (5)将构建的基因表达载体成功导入大肠杆菌后，研究人员发现只有含R3与RX扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃，原因可能是_____________。 8．（九师预测）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与Ti质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中，以获得转基因菊花。回答下列问题： (1)图2所示Ti质粒作为基因工程的载体，未标注出的结构元件是______，其作用是______。 (2)若仅利用EcoRI切割基因C和图2中Ti质粒，并进行重组，可能会出现______，可行的解决方案是：______。 (3)将含基因C的重组质粒导入农杆菌前常需要用______处理农杆菌，以方便重组质粒进入农杆菌。用含重组质粒的农杆菌侵染菊花愈伤组织后，通过______，可筛选出含有重组质粒的菊花细胞，后经过______技术即可获得转基因菊花。 (4)研究发现，大部分转基因菊花成功表达了基因C，花色发生了改变，少数转基因菊花在当代或子代中出现了花色性状不稳定甚至丢失的现象，可能的原因是______（答两点）。 9．（华大联盟预测）为研究Lcat基因在肝脏代谢疾病中的作用，科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠11号染色体的H11位点（安全位点）插入Lcat基因，再通过代际杂交获得肝脏特异性表达Lcat的小鼠，流程如图1。图1中Cre小鼠的肝细胞可特异性表达Cre蛋白，Cre基因能调控目的基因在肝脏中的特异性表达。 回答下列问题： (1)据图1分析，CRISPR/Cas9基因编辑技术中，通过碱基互补配对识别靶DNA位点，Cas9蛋白可切割靶DNA将双链断裂，具有的功能类似于________酶的作用。 (2)图1中启动子的功能是________。在构建重组质粒的过程中，若要将图1中的Lcat基因插入质粒，切割质粒应选择的酶为________（填标号）。 ①Sau3A I：5'-↓GATC-3'；②Hind Ⅲ：5'-A↓AGCTT-3'；③Bcl I：5'-T↓GATCA-3'；④Xba I：5'-T↓CTAGA-3' (3)采用PCR技术检测Lcat基因在H11位点的插入情况，PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现Lcat基因的指数形式扩增。为确保扩增的特异性，引物的碱基序列应与Lcat基因的________端碱基序列互补。 (4)对图1中的实验小鼠和野生型（WT）小鼠的相关DNA进行凝胶电泳，结果如图2所示。根据电泳图谱分析，属于F2小鼠的是________（填“1”、“2”、“3”或“4”）。若验证Lcat基因在肝脏中特异性表达，可以从F2小鼠的肝脏和其他组织（如肌肉）中提取________，进行分子杂交检测。 (5)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在H11位点插入Lcat基因的优势是________（答一点）。 10．（鹤壁一模）人血清白蛋白（HSA）是人血浆中主要的蛋白质，HSA的主要生理功能是维持血液胶体渗透压，临床上可用于烧伤或严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中的治疗。科学家利用PCR扩增HSA基因并构建了血清白蛋白植物表达载体（如下图），以紫花苜蓿子叶愈伤组织为受体细胞，通过农杆菌转化法进行遗传转化，获得了稳定表达HSA的转基因紫花苜蓿。回答下列问题： (1)扩增时应选用的引物是_______，并在引物的_______端加上Kpn I 或Sal I的识别序列。PCR循环一次需要经历变性、_______、_______等步骤。 (2)将扩增所得的HSA基因和质粒分别进行酶切，再利用_______酶将二者连接起来，将得到的重组质粒与农杆菌混合，并进行转化。提取农杆菌基因组，用（1）中的引物进行PCR，并用Kpn I和Sal I进行酶切，酶切产物电泳结果如下图，其中1号和4号分别是质粒（Kpn I和Sal I酶切位点间的距离忽略不计）和目的基因对照组，2号和3号中含有重组质粒酶切产物的是______。 (3)将转化后的农杆菌导入紫花苜蓿子叶愈伤组织细胞中，若HSA基因整合到了紫花苜蓿的染色体DNA上，则该愈伤组织细胞对_______有抗性；该转基因紫花苜蓿子叶愈伤组织细胞对另一种抗生素没有抗性的原因是_______。 11．(安阳预测)为培育“一次播种、多季收获”的多年生水稻，我国科学家将长寿基因EBTl与匍匐生长基因 PROG1、TIG1融合，成功培育出可在海南存活至少两年的“类野生稻”植株。该研究部分过程如下图所示，其中数字1~6表示引物种类，a~f表示基因的脱氧核苷酸链，其中a、c、e为转录的模板链，箭头表示引物的方向，回答下列问题： (1)为了先将基因 PROG1、TIG1成功连接，研究人员需在引物_____的5′ 端添加两基因非模板链上的部分互补碱基序列“搭桥”将两个基因连接，从而获得融合基因。为提高PCR扩增的特异性，可采取的措施有_____ （答出2点）。 (2)构建基因表达载体过程中，需要用到的限制酶是_____。用含四环素的普通培养基_____（填“能”或“不能”）筛选出成功转化重组质粒的菌株。 (3)据图可知，将融合基因导入水稻细胞的方法是_____。将融合基因导入水稻细胞后，可通过_____技术检测融合基因是否成功转录；若要从个体水平验证融合基因表达成功，可进行的操作及预期结果是_____。 12．（郑外模拟）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 (1)已知目的基因①处的碱基序列为5＇-CCTTTCAGCTCA -3＇，为保证hCGβ基因正确插入质粒并表达，则设计①端对应的引物序列是5＇-_________-3＇（只写出从5＇端开始的前15个碱基），同时需在目的基因的②端添加_______限制酶的识别序列。为获取较多的目的基因，可进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、______、_______、引物、Mg2+、缓冲液等，扩增过程可分为_________三步。 (2)图示hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是____________。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是________。 (3)阶段Ⅱ在含有_________的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌，之后进一步进行重组DNA扩增。 (4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基________（填“需要”或“不需要”）添加组氨酸，可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取__________（填“上清液”或“沉淀物”），依据_________原理进行分子水平的检测。若能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 13．（洛阳3月检测）利用基因工程技术生产人胰岛素的两种途径，其中途径1利用转基因牛作为乳腺生物反应器，途径2利用转基因大肠杆菌进行发酵生产。 回答下列问题： (1)获得基因工程所用的胰岛素基因，需先从人体胰岛B细胞的细胞质中获得mRNA，经________催化获得cDNA，利用PCR技术获得大量的胰岛素基因。构建重组质粒过程中，最好选用的限制酶是________。 (2)某同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物方向）。该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。无扩增产物的实验有________；实验⑥扩增出的DNA产物是________。 实验 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 无 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (3)途径1中为使目的基因能在乳腺细胞中表达，应将该基因与________的基因的启动子重组在一起；途径2筛选含目的基因大肠杆菌菌株的实验思路是________。 14．（郑州二测）烟粉虱是一个包含数十个隐存种（形态上难以区分，但存在不同程度的生殖隔离的独立物种）的物种复合群。研究人员常采用mtCOIPCR-RFLP（限制性片段长度多态性）技术进行烟粉虱隐存种的鉴定，其操作流程如下： 注：mtCOI基因指线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因，PCR扩增mtCOI基因片段时使用的是通用引物，能扩增出不同烟粉虱隐存种的mtCOI基因片段。 请回答下列问题： (1)提取烟粉虱DNA样品时，体积分数为95%的酒精以及2 mol/L的NaCl溶液的作用分别为______。 (2)某同学以mtCOI基因片段为模板，设计了如下两组通用引物，长度为18~22bp。请分析这2组引物的设计是否合理并说明理由：________。 (3)以4种烟粉虱隐存种为例，其mtCOI序列的酶切图谱如图甲所示。研究人员使用mtCOIPCR-RFLP技术对图甲中的4种烟粉虱隐存种进行了鉴定，电泳结果如图乙所示。结合图甲分析，图乙是利用______（填“TaqⅠ”或“VspⅠ”）酶鉴定的结果，说明其使用缺点为_______，造成该缺点的原因为_______。进一步地，可采用_______的方法进行检测，以获得准确的鉴定结果。 图甲注：黑色横条代表mtCOI基因片段。MED、MEAM1、AsiaII3、AsiaII9为不同隐存种的名称。TaqI和VspI为两种不同的限制酶，其识别位点以箭头表示。图乙注：该电泳使用的凝胶由1.2%的琼脂糖溶液制成，对条带大小较为接近的DNA片段区分度有限。 (4)实验室内，SlAnn5蛋白过表达的番茄在对烟粉虱的抗性上表现优异，在下一步的田间试验中，除关注SlAnn5蛋白过表达番茄的抗虫效果外，还应关注_______（从不同角度答出2点即可）等问题。 15．（信阳二模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员利用重叠延伸PCR（重叠链相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的DNA片段拼接起来）将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。利用重叠延伸PCR获取融合基因的基本过程如图1所示，所用的Ti质粒如图2所示，请回答下列问题： 注：Nco Ⅰ、BamH Ⅰ、Sac Ⅰ、Sal Ⅰ为限制酶酶切位点。启动子1、2属于真核细胞表达系统，Sm+是链霉素抗性基因，Amp+是氨苄青霉素抗性基因，GUS基因编码的酶能将无色物质X-Gluc分解，使植物细胞呈蓝色。 (1)PCR反应体系中需加入______（答两点）、4种脱氧核苷酸、引物、Mg2+、缓冲液等。PCR反应中的每次循环一般分为变性、______、延伸三步。 (2)图1中的PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，原因是______。为了重叠链顺利延伸，杂交的两条链分别为______（从字母“a”“b”“c”“d”中选）。获得融合基因后，用引物1和4继续进行PCR大量扩增该序列。 (3)根据图2中Ti质粒的结构及后续筛选的需要分析，在设计引物1和4时需分别加入限制酶______的识别序列。经过相应酶切处理后，将融合基因与该质粒在DNA连接酶作用下形成重组质粒。为了提高重组质粒导入农杆菌的效率，一般要用______处理农杆菌。 (4)用农杆菌侵染拟南芥后，为了将被侵染的拟南芥细胞进行脱菌处理以及筛选含有融合基因的拟南芥细胞，培养基上需要添加______。然后，通过______技术可培育出完整的转基因拟南芥植株。 (5)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的分布和含量。 16．（濮阳二模）人原癌基因erbB2编码的p185蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，该过程中人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。科研人员利用动物细胞融合技术制备相应的鼠源单克隆抗体（如图1），以期治疗肿瘤。回答下列问题： (1)为获得特异性识别p185蛋白的单克隆抗体，需要先向小鼠体内注射______（填“人肿瘤细胞”或“p185蛋白”）；为制备鼠源单克隆抗体，正确的操作顺序是______。 ①促融②选择培养基筛选③克隆化培养④分离脾脏中的B细胞和培养骨髓瘤细胞 (2)鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员构建人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如图2（已知人和鼠抗体的可变区基因和恒定区基因均可获得）。图中引物1、引物2折线部分表示不与融合基因序列互补配对；a链为转录时的编码链。 ①根据以上信息和图1推测，融合基因应包含______。 A．人抗体可变区基因  B．鼠抗体可变区基因 C．人抗体恒定区基因  D．鼠抗体恒定区基因 ②为保证连接准确性和效率，图2步骤a应选用的限制酶为_______；引物1折线部分为_______的识别序列。（选填编号） I．MboI  Ⅱ．XbaI  Ⅲ．ScaI ③图2步骤b常用的方法为______。加入四环素后，选用发_______（填“红色”或“蓝色”）荧光的受精卵用于后续操作。 (3)检测发现，转基因小鼠乳汁中嵌合抗体含量较低，推测可能原因是______。（答出2点） 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $